대부분의 실험은 식민지화에 초점을 맞추어 식물 세균 상호 작용을 연구하지만, 우리의 프로토콜은 식민지화와 뿌리에 박테리아의 유지 보수를 모두 볼 수 있도록 설계되었습니다. 우리는 다른 박테리아와 식물에 맞게 실험을 변경할 수 있습니다, 우리는 각 24 웰 플레이트에 여러 박테리아를 테스트 할 수 있습니다. 먼저 표준 구멍 펀처를 사용하여 플라스틱 메시 디스크를 만듭니다.
유리 용기에 디스크를 수집하고 느슨하게 덮습니다. 20분 건조 사이클로 설정된 오토클레이브세트를 사용하여 멸균합니다. 화염 멸균 핀셋을 사용하여 이전에 준비된 식물 성장 매체 한정판의 표면에 약 40개의 멸균 메쉬 디스크를 단일 층으로 분배합니다.
이전에 살균된 씨앗 2개를 각 메시의 중앙에 놓습니다. 수술 용 테이프로 접시를 밀봉하고 어둠 속에서 섭씨 4도에서 2 ~ 6 일 동안 배양하여 씨앗을 구사합니다. 그런 다음, 접시 한천을 식물 성장 챔버에 8~10일 동안 식물 성장 챔버에 내려놓고, 섭씨 21도에서 9시간의 빛의 짧은 낮 설정과 18°C에서 15시간 동안 어두워서 묘목을 발아하고 성장시합니다.
멸균 24웰 플레이트의 각 웰에 세균 성장 배지 1밀리리터를 넣습니다. 메쉬에 내장된 발아 모종을 옮기려면 화염 멸균 된 집게를 사용하여 발아, 동등하게 크기 및 손상되지 않은 모종을 받은 두 개의 메시를 부드럽게 벗겨냅니다. 묘목으로 플로트 1개를 세균 성장 액의 각 우물로 옮기고 뿌리쪽을 아래로 옮길 수 있습니다.
다음으로, 액체 세균 성 성장 매체에 있는 천 접시에 하룻밤 재배 하는 박테리아를 다시 일시 중단. 10 마이크로리터의 세균 현탁액을 각 우물에 추가하여 미디어 전용 제어 우물을 제외하고, 우물당 100만 개의 식민지 형성 단위의 최종 농도를 제공합니다. 멸균 성장을 위해 플레이트를 밀봉하려면 끈적끈적한 면을 건드리지 않고 플레이트 를 가로 질러 가스 투과성 필름을 조심스럽게 누릅니다.
각 우물이 개별적으로 밀봉되었는지 확인하기 위해 우물에서 만든 각 고리 주위에 압력을 가하십시오. 그런 다음 플라스틱 뚜껑으로 가스 투과성 필름 위로 접시를 가두어 닫습니다. 220 rpm으로 설정된 궤도 플레이트 셰이커에 식물 성장 챔버에 플레이트를 놓고 모종과 동일한 조건에서 18 시간 동안 배양하십시오.
모든 수레를 식물로 헹구려면 새로운 24웰 플레이트의 각 웰에 멸균 수분 1밀리리터를 넣습니다. 식물과 접시에서 가스 투과성 필름을 제거하고, 물과 우물에 수레를 전송하기 위해 멸균 집게 를 사용하고, 동요없이 실온에서 10 분 동안 배양. 그런 다음, 식물 성장 매체의 1 밀리리터와 새로운 24 웰 플레이트의 각 우물을 채웁니다.
하나의 메쉬를 각 웰로 옮기고 가스 투과성 씰로 덮습니다. 식물 성장 챔버에서 220 rpm에서 궤도 플레이트 셰이커에 72 시간 동안 배양하십시오. 인큐베이션 후, 이전에 했던 대로 식물을 헹구는 다.
헹구후 메시의 잎 면 아래에 화염 멸균 포셉을 부드럽게 배치하여 메시에서 모종을 제거합니다. 줄기를 가볍게 꼬집어 메시에서 모종을 흔들어 뿌리를 깨지 않고 빼내도록 합니다. 식물 뿌리에서 박테리아를 제거하기 위해 각 메쉬에서 모종을 이중 증류수 1밀리리터를 포함하는 24웰 초음파 플레이트의 개별 우물로 옮기습니다.
원고에 설명된 다중 소닉레이터를 사용하여 플레이트 내의 모든 샘플을 한 번에 초음파 처리합니다. 박테리아를 정량화하기 위해 세균 성장 배지에서 초음파 처리된 시료의 10배 희석을 연속적으로 수행합니다. 멸균 유리 구슬을 사용하여 확산하고, 개별 식민지가 계산 될 때까지 박테리아에 대한 최적의 온도에서 배양.
그대로 식물 루트를 수집하려면 집게를 사용하여 메시에서 모종을 제거합니다. 그런 다음 각 식물을 슬라이드에 루트 의 끝을 배치하고 팁에서 드래그하여 슬라이드로 플러시를 내려 놓아 최상의 이미징을 위한 직선 루트를 보장하여 현미경 슬라이드로 옮겨넣습니다. 각 샘플에 물 또는 멸균 식물 성장 매체를 추가하여 커버립과 슬라이드 사이의 인터페이스를 수화합니다.
유리 커버슬립을 루트 크라운 바로 위와 촬영 잎 아래에 놓고 덮개 슬립의 기울기를 피하고 부드럽게 누릅니다. 그런 다음 적절한 여기/방출 필터를 사용하여 박테리아를 이미지하여 박테리아를 서로 구별하고 식물 뿌리가 분화합니다. 슈도모나스 시미아, 자연적으로 형광균, 식민지 아라비도시스 탈리아나 뿌리 및 식물 성장 매체로의 이송 후 뿌리에 유지되었다.
뿌리 크라운, 중간 길이 및 팁은 슈도모나스 시미아의 식민지화로 인한 형광을 보여줍니다. 박테리아 가 없는 부정적인 대조군 식민지를 보였다. 아라비도시스 탈리아나 뿌리에 대한 슈도모나스 시미아가 18시간의 식민지화 또는 72시간의 유지 보수 후에 정량화되었을 때, 어느 시점에서 모종당 콜로니 형성 단위의 총 수는 다른 날에 수행된 생물학적 복제에 걸쳐 양호한 재현성을 보였다.
콜로니엄 후 18시간 시점에서 관찰된 수치에 비해 72시간 후 모종당 콜로니형성 유닛의 수가 증가하여, 유지보수 단계에서 식민지화된 박테리아의 활성 성장이 발생했음을 나타낸다. 실험실 조건하에서 자연 토양에서 자란 아라비도시스 탈리아나에서 분리된 3종의 박테리아가 식물 뿌리에 대한 여러 종의 연관성을 모니터링하는 데 사용되었습니다. 그들은 식민지 형태와 색상의 차이로 인해 X-gal을 함유 하는 미디어에 명확 하 게 분화 되었다, 항생제 선택 없이 각 종의 모종 당 식민지 형성 단위를 계산 허용, 심지어 다종 공동 문화에서.
박테리아의 이 3종은 모두 식민지화되었고, 단독으로든 세균성 공동문화이든 루트에서 유지되었다. 각 종은 다른 생물학적 및 기술적 복제에 걸쳐 유사한 추세를 보여 주었다, 이 프로토콜은 각 종의 뿌리 당 상대적 또는 총 식민지 형성 단위를 측정하는 데 사용할 수 있음을 보여주는. 혼자 성장할 때, 개별 종은 유지 보수 단계 도중 풍부하게 상당한 증가를 보여주지 않았습니다, 그러나 결합된 지역 사회의 근원 당 전반적인 식민지 형성 단위는 다른 긴장의 식민지화를 금지하지 않는다는 것을 나타내는 결합된 지역 사회의 뿌리 당 증가했습니다.
가장 어려운 단계는 메시 디스크에서 그대로 식물을 제거해야하는 단계입니다. 인내심이 있고 온화하면 이것이 가능해집니다. 세균성 세포가 형광인 경우에, 견본은 세포의 상대적인 수를 결정하기 위하여 혈류 세포측정에 의해 분류될 수 있었습니다.
