Большинство экспериментов исследования растительных микробов взаимодействия, сосредоточив внимание на колонизации, но наш протокол предназначен для смотреть как на колонизацию и поддержание бактерий на корню. Мы можем изменить эксперимент, чтобы соответствовать различным бактериям и растениям, и мы можем даже проверить несколько бактерий в каждой 24-хорошо пластины. Для начала используйте стандартный перфоратор отверстия для создания дисков из пластиковой сетки.
Соберите диски в стеклянном контейнере, и крышка свободно. Стерилизовать с помощью автоклава установить на 20-минутный сухой цикл. Используйте стерилизованные пламенем пинцеты для распределения примерно 40 стерилизованных сетчатых дисков в одном слое по всей поверхности ранее подготовленной средней агарной пластины роста растений.
Поместите два ранее стерилизованных семян в центре каждой сетки. Печать пластины с хирургической лентой, и инкубировать в течение двух-шести дней при четырех градусах по Цельсию в темноте, чтобы vernalize семена. Затем поместите тарелку агар-стороне вниз в камеру роста растений в течение восьми до 10 дней в условиях короткого дня девять часов света при 21 градусов по Цельсию и 15 часов темноты при 18 градусов по Цельсию, чтобы прорасти и вырастить саженцы.
Добавьте один миллилитр среды роста бактерий к каждому колодец стерильной пластины 24-хорошо. Для переноса проросшие саженцы, встроенные в сетку, используйте стерилизованные пламенем типсы, чтобы аккуратно очистить сетку, содержащую две проросшие, одинакового размера, и неповрежденные саженцы вверх и с агарной пластины. Передача одного поплавка с рассадой в каждый колодец бактериального роста жидкости, корневой стороне вниз.
Далее, resuspend бактерий, выращенных на ночь на агар пластин в жидкой бактериальной среды роста. Добавьте 10 микролитров бактериальной суспензии к каждой скважине, за исключением только медийных контрольных скважин, для окончательной концентрации одного миллиона колониообразующих единиц бактерий на скважину. Чтобы запечатать пластину для стерильного роста, осторожно нажимайте газоназную пленку по всей пластине, не касаясь липкой стороны.
Нанесите давление вокруг каждого из колец, сделанных скважинами, чтобы гарантировать, что каждая скважина была индивидуально запечатана. Затем закройте пластину пластиковой крышкой над газооемкой пленкой. Поместите пластину в камеру роста растения на шейкере орбитальной пластины, установленном до 220 об/мин, и инкубировать в течение 18 часов в тех же условиях, что и саженцы, первоначально проросшие.
Чтобы промыть все поплавки растениями, добавьте по миллилитр стерильной воды в каждый колодец новой пластины из 24 колодец. Снимите газонапную пленку с плиты растениями и используйте стерильные типсы для переноса поплавков в колодцы с водой и инкубировать в течение 10 минут при комнатной температуре без возбуждения. Затем заполните каждый колодец новой 24-хорошо пластины с одним миллилитром среды роста растений.
Перенесите по одной сетке на каждую колодец и накройте газоназной печатью. Инкубировать в течение 72 часов на орбитальной плите шейкер при 220 об/мин в камере роста растений. После инкубации, промыть растения, как это было сделано ранее.
После полоскания, удалить саженцы из сетки, аккуратно поместив огнеметных типсов ниже листьев на стороне листа сетки. Слегка щепотку стебля, и шевелить саженцы вверх и от сетки, чтобы выбить корень, не нарушая его. Чтобы удалить бактерии из корней растений, перенесите саженцы из каждой сетки в отдельные колодцы 24-хорошо sonication пластины, содержащей один миллилитр двойной дистиллированной воды.
Sonicate все образцы в пластине сразу с помощью многоцелевого sonicator, как описано в рукописи. Для количественной оценки бактерий, выполнить серийные 10-кратное разбавления sonicated образцов в среде роста бактерий. Распространение с использованием стерильных стеклянных бусин, и инкубировать при оптимальной температуре для бактерий, пока отдельные колонии не подсчитываются.
Чтобы собрать неповрежденный корень растения, используйте типсы, чтобы удалить саженцы из сетки. Затем перенесите каждое растение на слайд микроскопа, поместив кончик корня на слайд и перетащив его от кончика, чтобы установить сбивать флеш с слайдом, обеспечивая выпрямленный корень для лучшей визуализации. Добавьте каплю воды или стерильную среду роста растений к каждому образцу, чтобы увлажнить интерфейсы между крышками и слайдами.
Поместите стеклянную крышку чуть выше корневой короны и ниже стрелять листья, чтобы избежать наклона крышки, и нажмите вниз мягко. Затем, изображение бактерий с помощью соответствующих возбуждения / выбросов фильтры дифференцировать бактерии друг от друга и корень растения. Pseudomonas simiae, естественно флуоресцентная бактерия, колонизировала корни арабидопсиса талианы и была сохранена на корне после перехода к среде роста растений.
Корневая корона, середина длины и кончик показывают флуоресценцию из-за колонизации Pseudomonas simiae. Отрицательный контроль без бактерий не показал колонизации. Когда Pseudomonas simiae на корнях арабидопсиса талиана были количественно после 18 часов колонизации или 72 часов обслуживания, общее количество колоний формирования единиц на рассаду в любой момент времени показали хорошую воспроизводимость через биологические репликации выполняется в разные дни.
По сравнению с числом единиц, образующих колонию на саженец после 72 часов в среде технического обслуживания, по сравнению с числами, наблюдаемыми на посткоолонизации 18-часовой точки времени, что свидетельствует о том, что активный рост колонизированных бактерий на корне растения произошел на этапе технического обслуживания. Три вида бактерий, изолированных от арабидопсиса талиана, выращенных в естественной почве в лабораторных условиях, были использованы для мониторинга связи нескольких видов на корнях растений. Они были четко дифференцированы по средствам массовой информации, содержащим X-gal из-за различий в морфологии и цвете колонии, что позволило считать колониообразующие единицы на саженец каждого вида без отбора антибиотиков, даже в многовидовой кокультуре.
Все эти три вида бактерий были колонизированы и сохранены на корне, будь то в одиночку или в бактериальной кокультуре. Каждый вид показал тенденции, которые были похожи по различным биологическим и техническим репликациям, показывая, что этот протокол может быть использован для измерения как относительных, так и общих единиц колонии на корень каждого вида. Когда выращивали в одиночку, ни один отдельный вид не показал существенного увеличения изобилия на этапе технического обслуживания, но общая колония формирования единиц на корень комбинированного сообщества увеличилось в кокультуры, что свидетельствует о том, что эти бактерии не запрещают колонизацию других штаммов.
Наиболее сложными шагами являются те, которые требуют удаления нетронутых растений из сетчатых дисков. Быть терпеливым и нежным сделает это возможным. Если бактериальные клетки флуоресцентные, образцы могут быть отсортированы по цитометрии потока для определения относительного количества клеток.
