Çoğu deney kolonizasyona odaklanarak bitki-mikrop etkileşimlerini inceler, ancak protokolümüz kökteki bakterilerin hem kolonizasyonuna hem de bakımına bakmak için tasarlanmıştır. Deneyi farklı bakteri ve bitkilere uyacak şekilde değiştirebiliriz ve hatta her 24 kuyuluk tabakta birden fazla bakteriyi test edebiliriz. Başlamak için, plastik örgü diskleri oluşturmak için standart bir delik zımba kullanın.
Bir cam kapta diskleri toplamak ve gevşek kapağı. 20 dakikalık kuru bir döngü ye ayarlanmış bir otoklav kullanarak sterilize edin. Daha önce hazırlanmış bitki büyüme orta agar plaka yüzeyinde tek bir tabaka içinde yaklaşık 40 steril örgü diskler dağıtmak için alev sterilize cımbız kullanın.
Her kafesin ortasına önceden sterilize edilmiş iki tohum yerleştirin. Tabağı cerrahi bantla kapatın ve tohumları eritmek için karanlıkta dört derece lik bir sıcaklıkta 2-6 gün kuluçkaya yat. Daha sonra, çimlenme ve fide büyümek için 21 santigrat derece ve 15 saat karanlık 15 saat ışık dokuz saat kısa gün ayarları altında sekiz ila 10 gün boyunca bir bitki büyüme odasında aşağı plaka agar tarafı yerleştirin.
Steril 24 kuyulu bir plakanın her kuyuya bir mililitre bakteri büyüme ortamı ekleyin. Mesh gömülü çimlenmiş fideaktarmak için, yavaşça iki çimlenmiş içeren örgü soymak için alev steril leştirilmiş çiflikler kullanın, eşit büyüklükte, ve zarar görmemiş fideler yukarı ve agar plaka kapalı. Bir float ile fide ile bakteriyel büyüme sıvı her kuyuya, kök tarafı aşağı aktarın.
Daha sonra, sıvı bakteri büyüme orta agar plakaları üzerinde bir gecede yetiştirilen bakterileri resuspend. Her kuyuya 10 mikrolitre bakteriyel süspansiyon ekleyin, sadece medya kontrol kuyuları hariç, her kuyuda bir milyon koloni oluşturan bakteri birimlerinin son konsantrasyonu için. Plakayı steril büyüme için mühürlemek için, yapışkan tarafa dokunmadan gaz geçirilebilir filmi plaka boyunca dikkatlice bastırın.
Her kuyunun ayrı ayrı mühürlenmiş olduğundan emin olmak için kuyular tarafından yapılan halkaların her birinin etrafına basınç uygulayın. Daha sonra, gaz geçirilebilir film üzerinde snuggly plastik kapağı ile plaka kapatın. 220 rpm olarak ayarlanmış bir yörünge plaka shaker bir bitki büyüme odasına plaka yerleştirin ve fideler başlangıçta çimlenmiş olduğu gibi aynı koşullar altında 18 saat kuluçka.
Tüm bitkileri ile yüzer durulamak için, yeni bir 24-well plaka her kuyuya steril su bir mililitre ekleyin. Bitkilerle birlikte plakadan gaz geçirilebilir filmi çıkarın ve su ile kuyulara yüzen aktarmak için steril forseps kullanın ve ajitasyon olmadan oda sıcaklığında 10 dakika kuluçka. Daha sonra, bitki büyüme orta bir mililitre ile yeni bir 24-well plaka her kuyu doldurun.
Her kuyuya bir örgü aktarın ve gaz geçirilebilir bir mühürle kaplayın. Bitki büyüme odasında 220 rpm orbital plaka shaker üzerinde 72 saat kuluçka. Kuluçkadan sonra, daha önce yapıldığı gibi bitkileri durula.
Duruladıktan sonra, kafesin yaprak tarafındaki yaprakların altına alevle sterilize edilmiş ençeleri yavaşça yerleştirerek fideleri örgüden çıkarın. Sapı hafifçe çimdikle ve fideleri kırmadan kökü yerinden çıkarmak için örgüden yukarı ve uzağa doğru çekin. Bitki köklerinden bakterileri uzaklaştırmak için, her bir kafesten fidelerin bir mililitre çift distile su içeren 24 kuyuluk bir sonication plakasının ayrı kuyularına aktarılması.
El yazmasında açıklandığı gibi çok yönlü bir sonicator kullanarak plaka içindeki tüm örnekleri aynı anda sonicate. Bakterileri ölçmek için, bakteri büyüme ortamında sonicated örneklerinin seri 10 kat seyreltme gerçekleştirin. Steril cam boncuklar kullanarak yayılır ve tek tek koloniler sayılabilir olana kadar bakteriler için en uygun sıcaklıkta kuluçkaya yat.
Bozulmamış bitki kökü toplamak için, örgü fideler kaldırmak için forceps kullanın. Daha sonra, her bitkiyi kökün ucunu slayta yerleştirerek ve uçtan uzağa sürükleyerek slaytla çekimi aşağı doğru ayarlayarak en iyi görüntüleme için düzleştirilmiş bir kök sağlayarak bir mikroskop slaytına aktarın. Kapaklar ve slaytlar arasındaki arayüzleri nemlendirmek için her numuneye bir damla su veya steril bitki büyüme ortamı ekleyin.
Kapak kaymasının eğimini önlemek için kök taç ve sürgün yapraklarının altına cam bir kapak kaydırın ve hafifçe bastırın. Daha sonra, bakterileri birbirinden ve bitki kökünden ayırt etmek için uygun uyarma/emisyon filtrelerini kullanarak bakterileri görüntüleyin. Pseudomonas simiae, doğal floresan bakteri, kolonize Arabidopsis thaliana kökleri ve bitki büyüme ortamınakil aşağıdaki kök üzerinde muhafaza edildi.
Kök taç, orta uzunlukta, ve ucu Pseudomonas simiae kolonizasyonu nedeniyle floresan göstermektedir. No-bakteri negatif kontrol hiçbir kolonizasyon gösterdi. Arabidopsis thaliana köklerindeki Pseudomonas simiae'si 18 saatlik kolonizasyon veya 72 saatlik bakımdan sonra ölçüldüğünde, her iki zaman noktasında da fide başına koloni oluşturan birimlerin toplam sayısı farklı günlerde yapılan biyolojik kopyalar arasında iyi bir tekrarlanabilirlik göstermiştir.
Bakım aşamasında 72 saat sonra fidan başına koloni oluşturan birimlerin sayısında bir artış yaşandı, kolonizasyon sonrası 18 saatlik zaman diliminde gözlenen sayılarla karşılaştırıldığında, bitki kökündeki kolonileşmiş bakterilerin aktif büyümesi bakım aşamasında meydana geldi. Laboratuvar koşullarında doğal toprakta yetişen Arabidopsis thaliana'dan izole edilen üç bakteri türü, bitki kökleri üzerinde birden fazla türün ilişkisini izlemek için kullanılmıştır. Koloni morfolojisi ve rengindeki farklılıklar nedeniyle X-gal içeren medyada açıkça ayırt edildiler ve bu da çok türlü bir kültürde bile antibiyotik seçimi olmaksızın her türün fidebaşına koloni oluşturan birimlerin saymasına olanak sağladı.
Bu üç bakteri türünün hepsi tek başına ya da bakteri kokültüründe kolonize edildi ve köküzerinde muhafaza edildi. Her tür farklı biyolojik ve teknik kopyalar arasında benzer eğilimler göstererek, bu protokolün her türün kökü başına göreceli veya toplam koloni oluşturan birimleri ölçmek için kullanılabileceğini göstermiştir. Tek başına yetiştirildiğinde, hiçbir tür bakım aşamasında bollukta önemli bir artış göstermedi, ancak birleşik toplumun kökü başına genel koloni oluşturan birimler, bu bakterilerin diğer suşların kolonizasyonunu yasaklamadığını göstererek, ortak kültürlerde arttı.
En zor adımlar, kafes disklerinden sağlam bitkilerin kaldırılmasını gerektiren adımlardır. Sabırlı ve nazik olmak bunu mümkün kılar. Bakteri hücreleri floresan ise, örnekler hücrelerin göreli sayısını belirlemek için akış sitometri tarafından sıralanmış olabilir.
