שיטות אופטיות, כגון אופטוגנטיקה יכולה לספק אפנון מדויק של אותות מולקולריים תאיים. הפרוטוקול שלנו הראה מניפולציה אופטית אוראלית של מולקולות אות תאי על ידי גירוי לייזר femtosecond. על ידי צימוד לייזר femtosecond שלנו לתוך מיקרוסקופ קונפוקלי, הטכניקה שלנו יכולה לספק פעולה ברמה חד-תאית או תת-תאית על ידי גירוי לייזר femtosecond וניטור דינמי בזמן אמת, מולקולרי על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית.
שיטה זו יכולה להיות מיושמת על כל מערכות מיקרוסקופיה פלואורסצנטיות על ידי צימוד לייזר femtosecond לתוך המערכת בצורה הנכונה. לכל מי שמנסה את השיטה שלנו בפעם הראשונה, אנא בצע את ההוראות הנפרדות של מתקן הלייזר או לחפש הדרכה מאנשי מקצוע בעת הפעלת מקור לייזר femtosecond מעבדה. כדי להתחיל, הפעל את לייזר femtosecond ואת מיקרוסקופ confocal.
השתמש במראות רפלקטיביות כדי לכוון את קרן הלייזר femtosecond דרך תריס מכני. לאחר מכן, הגדר טלסקופ ממסר המורכב מזוג עדשות כדי להרחיב את רוחב קרן השידור. זה צריך להיות עקבי עם הצמצם האחורי של המטרה.
עכשיו, לנווט את המראות רפלקטיביות כדי ליישר את הקרן המורחבת לתוך המיקרוסקופ. התאם את שתי המראות המחזפות, שצוין כאן, כדי לכוון את המוקד של לייזר femtosecond למרכז שדה המבט. לבסוף, למדוד ולכוונן את הלייזרים כמתואר בפרוטוקול הטקסט הנלווה.
תאי הלה תרבותיים בטכניקות סטנדרטיות. כאשר מוכן לבצע את הניסוי, לשנות את התאים עם ERK2-GFP כמתואר בפרוטוקול הטקסט הנלווה. לאחר מכן, הפעל את מיקרוסקופ קונפוקל סריקת לייזר femtosecond.
ודא כי תריס הלייזר סגור. לאחר מכן, פתח את תוכנת המיקרוסקופ. הגדר את לייזר העירור על 488 ננומטר, ולהגדיר את רמת הכוח שלה ב 0.1 מילי וואט.
הגדר את גודל ההדמיה כ- 512 על 512 פיקסלים ואת זמן המרווח של כל פיקסל כ- 2.4 מיקרו-שניות. לאחר מכן, הגדר את זמן המרווח בין שתי מסגרות בשש שניות כדי למזער הלבנת תמונות ונזק לתמונה לתאים. כמו כן, הגדר את מסגרות ההדמיה הכוללות בסביבות 300 מסגרות כדי לספק כ -30 דקות של מיקרוסקופיה רציפה בניסוי בודד.
קח את המנה המכילה את תאי הלה מנודים עם ERK2-GFP מהאינקובטור, ולשים את המנה על הבמה מיקרוסקופ. בתוכנה, הפעל מצב סריקה מהירה, ולכוונן את המטרה כדי להשיג תמונות פלואורסצנטיות ברורות של התאים. לאחר מכן, הפסיקו את הסריקה המהירה ולעבור למצב דימות שדה בהיר באמצעות מצלמת CCD.
פתח את התריס והתאם את המרחק בין שתי העדשות של טלסקופ הממסר כדי להבטיח כי קוטר מוקד הלייזר femtosecond הוא כשני מיקרון. לאחר מכן, סגור את התריס כדי להשלים את ההתאמה. הגדר את העוצמה של לייזר femtosecond ב 15 עד 40 מילי וואט עבור לייזר 810 ננומטר, או 20 עד 60 מיליוואט עבור לייזר 1040 ננומטר.
לאחר מכן, קבעו את זמן הפתיחה של התריס על 05 עד 0.2 שניות. השתמש במצב סריקה מהירה כדי לבחור תא יעד המבטא בחוזקה את ERK2-GFP. לאחר שנמצא, הזז את השלב כדי להפוך את אזור הציטוסול של תא היעד שנבחר ללאקליזציה כך שהוא יהיה במרכז שדה המבט כאשר הוא נמצא תחת הדמיה של שדה בהיר.
לאחר לחיצה על לחצן 'התחל' כדי להתחיל בהדמיה רציפה. פתח את התריס בכל משבצת זמן מוגדרת מראש כדי לספק את גירוי הלייזר femtosecond לתוך תא היעד. לאחר השלמת תהליך ההדמיה, שמור את נתוני ההדמיה לצורך ניתוח נוסף.
הגדר את העוצמה של לייזר femtosecond ב 15 עד 40 מילי וואט ו 810 ננומטר ו 20 עד 60 מילי וואט ו 1040 ננומטר בדגימה. לאחר מכן, קח את המנה המכילה תאים מנודים עם ERK2-GFP מהאינקובטור ולשים אותו על שלב המיקרוסקופ. השתמש במצב סריקה מהירה כדי לבחור את תא היעד היטב המבטא ERK2-GFP.
לאחר מכן, הגדר את תהליך ההדמיה הקונפוקל והגדר מסגרת סריקה מיוחדת כמסגרת הגירוי בתהליך ההדמיה. הגדר את הפרמטר של מסגרת הגירוי. הגדר אזור סריקה של שניים על שניים עד שלושה על שלושה מיקרונים רבועים באזור ציטוסול קרוב לגרעין בתא היעד.
הגדר את זמן הסריקה הכולל ב- 0.1 עד 0.2 שניות. הגדר את זמן המרווח בין שתי מסגרות בשש שניות והגדר את מסגרות ההדמיה הכוללות בסביבות 300 מסגרות כדי לספק כ-30 דקות של מיקרוסקופיה רציפה. שמור את נתוני הדימות לניתוח נתונים נוסף.
לסנכרן את התריס של לייזר femtosecond עם זה של סריקת confocal על פי אזור גירוי תמונה מוגדר מראש אשר פתוח רק כאשר סריקת הלייזר טיפות במסגרת הגירוי. לחץ על לחצן 'התחל' כדי להתחיל את תהליך הדמיית המיקרוסקופיה הרציף. כדי לבחון את הדינמיקה המורפולוגית המיטוכונדרית, החלף תאי הלה עם Mito-GFP כדי לציין באופן פלואורסצנטי את המיטוכונדריה, או בסיס עם mito-cpYFP כדי לצפות mitoflashes.
לאחר החיתוך, הפעל את הלייזר femtosecond וודא שהתריס סגור. לאחר מכן, הפעל את מיקרוסקופ קונפוקל סריקת לייזר. הגדר את לייזר העירור על 488 ננומטר.
לאחר מכן, להגדיר את רמת הכוח של לייזר 488 ננומטר ב 0.1 מיליוואט. בנוסף, הגדר את גודל ההדמיה ל- 512 על 512 פיקסלים ואת זמן ההדמיה הכולל של כל מסגרת ל- 2.2 שניות. לאחר מכן, הגדר את זמן המרווח בין שתי מסגרות באפס שניות ואת מסגרות ההדמיה הכוללות כ- 200 מסגרות כדי לספק כ- 440 שניות של מיקרוסקופיה רציפה בניסוי בודד.
קח את המנה המכילה תאים מגולפים עם Mito GFP או חלבון פלואורסצנטי צהוב מחודד באופן מעגלי מהאינקובטור ולשים את המנה על שלב המיקרוסקופ. בדוק את המצב של לייזר femtosecond כדי להבטיח כי המוקד של לייזר femtosecond ממוקם במרכז שדה המבט. לאחר מכן, הגדר חץ התייחסות במרכז חלון ההדמיה הפלואורסצנטי כדי לציין את מיקום המוקד.
לאחר מכן, להגדיר את הכוח של לייזר femtosecond ב 5 עד 30 miliwatts עם הלייזר ב 810 ננומטר ו 10 עד 40 מיליוואט עבור הלייזר ב 1040 ננומטר. הגדר את זמן הפתיחה של התריס ל- 05 עד 0.1 שניות. השתמש במצב סריקה מהירה כדי לבחור את תא היעד המבטא היטב את Mito GFP או את החלבון הפלואורסצנטי הצהוב הממוקד במיטוכונדריה.
בחר מיטוכונדריה אחת באופן אקראי בתא היעד כנושא הניסיוני. לאחר מכן, להזיז את שלב המיקרוסקופ על מנת לוקליזציה של מבנה צינורי המיטוכונדריאלי היעד במרכז השדה של התצוגה על ידי מצב סריקה מהירה כפי שצוין על ידי חץ הייחוס. לחץ על לחצן התחל כדי להתחיל דימות רציף.
לבסוף, לפתוח את התריס בכל זמן מוגדר מראש כדי לספק את גירוי לייזר femtosecond לתוך המבנה צינורי המיטוכונדריאלי היעד. המתן עד להשלמת תהליך ההדמיה ולאחר מכן שמור את נתוני ההדמיה לניתוח נתונים נוסף. באמצעות השיטה המוצגת בפרוטוקול זה, ERK2 טרנסלוקטוס לתוך הגרעין לאחר שטופלו עם הבזק קצר של לייזר femtosecond.
פלואורסצנטיות ERK2-GFP מגיעה למקסימום לאחר מספר דקות של גירוי לייזר femtosecond. מולקולות ERK2 יהיה dephosphorylated לאחר הפעלת מצעים במורד הזרם בגרעין ולאחר מכן ERK2 חוזר לציטופלסמה המצוין על ידי ירידה של פלואורסצנטיות GFP גרעינית. ERK2 יכול להיות מופעל מספר פעמים על ידי גירויים צילום מרובים.
לכן, ניתן לתפעל את תבנית האות ERK2 דווקא על ידי שליטה בזמן מרווח בין גירויים מרובים. בנוסף, ERK2 יכול מדי פעם להיות מופעל בתאים סמוכים סביב התא מגורה. תצפית זו מצביעה על כך שמולקולות מפוזרות מסוימות עשויות להשתחרר על ידי התא שטופל בלייזר femtosecond כדי להפעיל את ERK2 בתאים הסמוכים.
זרחון של ERK2 חלבון במורד הזרם eIF4E ניתן לאשר אישית על ידי מיקרוסקופיה immunofluorescence. תוצאה זו מציינת כי גירוי לייזר femtosecond יכול להפעיל בהצלחה את מסלול איתות ERK. הבזקים חמצוניים מיטוכונדריאליים או mitoflashes הם התפרצויות חמצוני המיטוכונדריה כי שורש מן הדינמיקה המולקולרית מורכבת.
יישום ערכת גירוי תמונה זו הביאה לגירוי mitoflash מוצלח. גירוי צילום זה מראה גם זנים של דינמיקה מולקולרית מיטוכונדריאלית כולל פיצול ושחזור של מורפולוגיה מיטוכונדריאלית, כמו גם תנודות של פוטנציאל קרום המיטוכונדריאלי. בדומה לתמונה מופעל mitoflashes, אלה אירועי המיטוכונדריה יש ביצועים שונים עם עוצמות כוח שונות.
הדבר החשוב ביותר הוא לוודא כי המיקוד, גודל ואת הדיוק של לייזר femtosecond הוא מאפיין לגירוי בתאים. לייזר femtosecond כמעט אינפרא אדום עלול להיות מסוכן למשתמשים. בעת ביצוע פרוטוקול זה, ללבוש הגנה נאותה וזה מונע את הלייזר להתפזר מהשולחן האופטי.
