הפרוטוקול המתואר כאן מספק לחוקרים שיטה לחקור נויטרופילים אוראליים בתוך מודל בעלי חיים הנגרמת על ידי קשירה של מחלת חניכיים באופן מקביל למשתתפים אנושיים. היתרון העיקרי של טכניקה זו מודגש על ידי נפח מוגבר של רקמות חניכיים מודלק זמין לניתוח הבא, אשר מפחית את השימוש בבעלי חיים. היכולת שלנו לאחזר את הקשירה מצופה הביופילם מסביב לשיניים מאפשרת סימולציה של טיפול יעיל במחלת חניכיים מקומית.
השימוש במודל זה יכול להיות מיושם בחקר ההשפעות המערכתיות של חניכיים במודל של בעלי חיים, בשל האזורים המוגברים של רקמות חניכיים מודלק. היכרות עם השימוש במכשירים מיקרוכירורגיים ומיקרוסקופים ניתוח, כמו גם קשירת קשרים של מנתח לפני הטיפול בנושאים בעלי חיים חיים, מומלץ מאוד. הדגמה חזותית של טכניקה זו היא קריטית בהפחתת אורך עקומת הלמידה הנדרשת להשגת מיקום קשירה מיומן.
מדגים את ההליך יהיה ג'ף צ'דוויג, סטודנט לתואר שני מהמעבדה שלי. התחל על ידי מיקום העכבר על פלטפורמה כירורגית מחוממת. לאחר הבטחת כי העכבר הוא הרדמה כראוי, לייצב את maxilla ו mandible במצב פתוח באמצעות להקות אלסטיות.
אביזר הצוואר עם גליל כותנה כדי לשמור על maxilla במצב אופקי לכסות את הגוף והזנב כדי למתן את אובדן החום. מקם את המיקרוסקופ הכירורגי בהגדלה הרצויה ותאורה על חלל הפה. השתמש מלקחיים רסיס להתקין תפר משי סטרילי 50 או קטן יותר קלוע סביב M1 ו M2 טוחנות maxillary בתוך סולקוס חניכיים.
מקם את הזנב הדיסטלי של התפר בצד הפאלאטלי של הנדנון והכנס את המקטע הפרוקסימלי בין מגע של M2 ו- M3. לאחר מכן, לעטוף אותו סביב פני השטח buccal של M2 ולהכניס אותו בין המגע של M1 ו M2. ודא כי שני הקצוות של התפר נמשכים בחוזקה כדי להסיע אותו אל גופרית חניכיים. לעטוף את קטע תפר proximal סביב M1 מתחת לגובה קווי המתאר שלה ולהכניס אותו בין המגע של M1 ו M2. משוך את הזנב הפרוקסימלי של התפר בחוזקה כדי להסיר את כל הרפוי. לקשור את הקצוות של התפר עם קשר של מנתח לקצץ את הזנבות כמו סוג ככל האפשר.
מניחים את הקשר במעיל החניך בין M1 ו- M2 בצד הפאלטלי של ההתמזגות המקסיאלית. זה קריטי כי הקשר המשמש לאבטחת הקשירה הוא מאובטח ובמיקום שבו זה לא ירגיז את החיה או להפריע mastication. לאחר התקנת הקשירה, מוציאים את העכבר מהמתקן הכירורגי ומ מניחים אותו בכלוב נקי מתחת למנורת חום, ומוודאים לנטר אותו עד להחזרה מלאה.
מעקרים את המכשירים הכירורגיים בחיטוי חמוזי הזכוכית החמה בין כל נושא של בעלי חיים. בנפרד בית כל עכבר עם העשרה סביבתית מתאימה ולאפשר גישה לליביטום מודעה למים מסוננים ו chow סטנדרטי מחית בסביבה מבוקרת טמפרטורה ולחות במשך שבעה עד 11 ימים. כאשר מוכן לאסוף דגימות, להשתמש פיפטה לשטוף את חלל הפה עם 100 microliters של PBS ארבע מעלות מעוקרים ללא סידן ומגנזיום במשך 10 שניות.
חזור על שטיפה פעמיים נוספות, הצבת כל לשטוף לתוך אותו 15 מיליליטר חרוט סטרילי מבחנה עבור כל בעל חיים. הפעל את התוכן של כל צינור 15 מיליליטר דרך מסנן רשת ניילון 40 מיקרומטר לתוך צינור חרוט 50 מיליליטר, ולהעביר את הסינון לתוך מבחנה חדשה 15 מיליליטר. הוסף 33.3 מיקרוליטרים של 16% paraformaldehyde כדי להקל על קיבעון מדגם.
מערבולת הדגימות מיד להדגירה אותם על קרח במשך 15 דקות. Paraformaldehyde הוא reagent המסוכן ביותר המועסקים בפרוטוקול ויש לטפל עם ציוד המגן האישי המומלץ מומלץ על ידי היצרן. לאחר הדגירה, למלא את הצינור ל 15 מיליליטר עם PBS ואז צנטריפוגה זה ב 1000xg וארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות.
שאפו את העל-טבעי, השהו מחדש את גלולת הכדור במיליליטר אחד של חיץ FACS בארבע מעלות צלזיוס וספירת התאים על מד חמוציטר או מונה תאים אוטומטי. חזור על הצנטריפוגה ושאוף את העל-טבעי. לאחר מכן, להשעות מחדש את גלולת התא בנפח המתאים של מאגר FACS עבור ריכוז סופי של 500, 000 כדי 1 מיליון תאים לכל 50 microliters של מאגר FACS ולהעביר את התאים לצינור FACS.
הוסף מיקרוליטר אחד של סרום עכברים ושני מיקרוליטרים של נוגדן IGG נגד עכברים ל-50 מיקרוליטרים של הדגימה. Vortex המדגם באופן מיידי לחסום אותו על קרח במשך 20 דקות. לאחר מכן, מוסיפים את הנוגדנים המתאימים לכל דגימה.
וורטקס ודגירה על קרח במשך 30 דקות בחושך. לאחר הדגירה, לשטוף את הדגימות עם מיליליטר אחד של חיץ FACS, מערבולת לזמן קצר, צנטריפוגה במשך חמש דקות ב 1000xg וארבע מעלות צלזיוס. השלך את העל-טבעי וחסום בעדינות את פתיחת צינור FACS.
חזור על הכביסה פעמיים ולאחר מכן השהה מחדש את הדגימות ב- 250 מיקרוליטרים של מאגר FACS לאחסון. מכסים את הצינורות בסרט פרפין, עוטפים אותם בנייר אלומיניום, ומאחסנים אותם בארבע מעלות צלזיוס עד שהם מוכנים לניתוח. ציטומטריית זרימה שימשה לניתוח נויטרופילים שנמצאו משטיפה אוראלית מעכבר נאיבי, כמו גם שטיפה אוראלית וקישורה התאוששה מעכבר עם דלקת מחזור הנגרמת על ידי קשירה.
כדי להעריך את אובדן עצם מכת המים, רמות העצם מכתב נמדדו מן סמל העצם מכתב אל צומת cementoenamel עבור עכברים בריאים קשירה. לאחר מכן, חושבו הבדלי המדידה. אמנם לא נבדק כאן, היסטופתולוגית, אימונוהיסטוכימית, והערכה מורפומטרית של מחזור ועצם מכתשית יכול להתבצע גם בהתאם לשאלת המחקר.
מודל זה נמצא כעת בשימוש במעבדה שלי כדי לחקור את ההשפעות של המערכת החיסונית המולדת אוראלי על בריאות מערכתית ומחלות.
