O protocolo descrito aqui fornece aos pesquisadores um método para estudar neutrófilos orais dentro de um modelo animal induzido por ligadura de doença periodontal de forma análoga aos participantes humanos. A principal vantagem dessa técnica é destacada pelo aumento do volume de tecidos gengival inflamados disponíveis para análise posterior, o que reduz o uso de animais. Nossa capacidade de recuperar as ligaduras revestidas de biofilme ao redor dos dentes permite a simulação de um tratamento eficaz de uma doença periodontal localizada.
O uso desse modelo poderia ser aplicado no estudo dos efeitos sistêmicos da periodontite em um modelo animal, devido ao aumento das áreas de tecidos gengival inflamados. A familiarização com o uso de instrumentos microcirúrgicos e microscópios de dissecção, bem como amarrar nós do cirurgião antes de manusear os animais vivos, é altamente aconselhável. A demonstração visual desta técnica é fundamental para reduzir o comprimento da curva de aprendizagem necessária para alcançar a colocação de ligaduras proficientes.
Demonstrando o procedimento será Jeff Chadwig, um estudante de pós-graduação do meu laboratório. Comece posicionando o mouse em uma plataforma cirúrgica aquecida. Depois de garantir que o mouse esteja devidamente anestesiado, estabilize a maxila e a mandíbula na posição aberta usando bandas elásticas.
Apoie o pescoço com um rolo de algodão para manter a maxila em uma posição horizontal e cubra o corpo e a cauda para mitigar a perda de calor. Posicione o microscópio cirúrgico na ampliação desejada e iluminação sobre a cavidade oral. Use fórceps de lasca para instalar uma sutura de seda trançada estéril ou menor ao redor dos molares maxilares M1 e M2 dentro do sulco gengival.
Posicione a cauda distal da sutura no lado palatal da dentição e insira o segmento proximal entre o contato de M2 e M3. Em seguida, enrole-o em torno da superfície bucal de M2 e insira-o entre o contato de M1 e M2. Certifique-se de que ambas as extremidades da sutura são puxadas firmemente para conduzi-la para o sulco gengival. Enrole o segmento de sutura proximal em torno de M1 abaixo de sua altura de contorno e insira-o entre o contato de M1 e M2. Puxe a cauda proximal da sutura firmemente para remover toda a folga. Amarre as extremidades da sutura com o nó de um cirurgião e corte as caudas o mais patria possível.
Coloque o nó na embrasure gengival entre M1 e M2 no lado palatal da dentição maxilar. É fundamental que o nó usado para fixar a ligadura seja seguro e em posição onde não irrite o animal ou interfira na mastigação. Após a instalação da ligadura, remova o mouse do aparelho cirúrgico e coloque-o em uma gaiola limpa sob uma lâmpada de calor, certificando-se de monitorá-lo até que esteja totalmente recuperado.
Esterilize os instrumentos cirúrgicos no esterilizador de contas de vidro quente entre cada sujeito animal. Abriga individualmente cada rato com o enriquecimento ambiental adequado e permite o acesso ad libitum à água filtrada e purê de comida padrão em um ambiente controlado por temperatura e umidade por sete a 11 dias. Quando estiver pronto para coletar amostras, use uma pipeta para enxaguar a cavidade oral com 100 microliters de PBS de quatro graus Celsius esterilizados sem cálcio e magnésio por 10 segundos.
Repita a lavagem mais duas vezes, colocando cada enxágue no mesmo tubo de ensaio estéril cônico de 15 mililitros para cada animal. Execute o conteúdo de cada tubo de 15 mililitros através de um filtro de malha de nylon de 40 micrômetros em um tubo cônico de 50 mililitros, e transfira o filtrado para um novo tubo de ensaio de 15 milímetros. Adicione 33,3 microliters de 16% de paraformaldeído para facilitar a fixação da amostra.
Vórtice as amostras imediatamente e incuba-as no gelo por 15 minutos. O paraformaldeído é o reagente mais perigoso empregado no protocolo e deve ser manuseado com os equipamentos de proteção individual recomendados pelo fabricante. Após a incubação, encha o tubo a 15 mililitros com PBS e depois centrifuá-lo a 1000xg e quatro graus Celsius por cinco minutos.
Aspire o supernatante, suspenda a pelota em um mililitro de tampão FACS a quatro graus Celsius e conte as células em um hemocitómetro ou contador celular automatizado. Repita a centrifugação e aspire o supernatante. Em seguida, suspenda novamente a pelota celular em um volume apropriado de tampão FACS para uma concentração final de 500.000 a 1 milhão de células por 50 microliters de tampão FACS e transfira as células para o tubo FACS.
Adicione um microliter de soro de rato e dois microliters de anticorpo iGG anti-rato a 50 microliters da amostra. Vórtice a amostra imediatamente e bloqueá-la no gelo por 20 minutos. Em seguida, adicione os anticorpos apropriados a cada amostra.
Vórtice e incubar no gelo por 30 minutos no escuro. Após a incubação, lave as amostras com um mililitro de tampão FACS, vórtice brevemente e centrífuga por cinco minutos a 1000xg e quatro graus Celsius. Despeje o supernatante e bloqueie suavemente a abertura do tubo FACS.
Repita a lavagem duas vezes e suspenda novamente as amostras em 250 microliters de tampão FACS para armazenamento. Cubra os tubos com filme de parafina, enrole-os em papel alumínio e armazene-os a quatro graus Celsius até que estejam prontos para analisar. A citometria de fluxo foi usada para analisar neutrófilos recuperados de uma lavagem oral de um rato ingênuo, bem como uma lavagem oral e ligadura recuperada de um camundongo com periodontite induzida por ligadura.
Para avaliar a perda óssea alveolar, os níveis ósseos alveolares foram medidos desde a crista óssea alveolar até a junção de cimentoenamel para camundongos saudáveis e ligados. Em seguida, foram calculadas as diferenças de medição. Embora não seja revisada aqui, a avaliação histopatológica, imunohistoquímica e morfométrica do osso periodontium e alveolar também pode ser realizada dependendo da questão da pesquisa.
Este modelo está sendo usado em meu laboratório para estudar os efeitos do sistema imunológico inato oral na saúde sistêmica e na doença.
