ここで説明するプロトコルは、ヒト参加者と同様の方法で歯周病の合字誘発動物モデル内の経口好中球を研究する方法を研究者に提供する。この技術の主な利点は、動物の使用を減らす後続の分析のために利用可能な炎症ギンジバル組織の量の増加によって強調されています。歯の周りからバイオフィルムコーティングされた合字を取り出す私達の能力は局在した歯周病の有効な処置のシミュレーションを可能にする。
このモデルの使用は、炎症を起こした歯肉組織の領域が増加したため、動物モデルにおける歯肉炎の全身効果の研究に適用することができる。微小手術用器具や解剖顕微鏡の使用に精通し、生きた動物の被験者を扱う前に外科医の結び目を結ぶことは、大いに助言されています。この手法の視覚的なデモンストレーションは、熟練した合字配置を達成するために必要な学習曲線の長さを短くする上で重要です。
この手順のデモンストレーションは、私の研究室の大学院生であるジェフ・チャドウィグです。まず、加熱された外科プラットフォームにマウスを配置します。マウスが適切に麻酔されていることを確認した後、弾性バンドを使用して開いた位置で上顎と下顎を安定させます。
水平位置に上顎を維持するために綿ロールで首を支え、熱損失を軽減するためにボディとテールを覆います。手術用顕微鏡を所望の倍率に置き、口腔の上に照明を置きます。スプリンター鉗子を使用して、歯肉スルカス内のM1およびM2上顎臼歯の周りに無菌50または小さな編組シルク縫合糸を取り付ける。
歯列の口蓋側に縫合の遠位尾を配置し、M2とM3の接触の間に近位セグメントを挿入します。そして、M2の頬面を包み込み、M1とM2の接触の間に挿入します。縫合糸の両端をしっかりと引っ張って歯肉スルカスに入れるようにします。近位縫合線セグメントを輪郭の高さより下の M1 の周りにラップし、M1 と M2 の接触の間に挿入します。縫合糸の近位尾をしっかりと引っ張って、すべてのたるみを取り除きます。縫合糸の端を外科医の結び目で結び、尾をできるだけ並べ替えます。
上顎歯列の口蓋側のM1とM2の間の歯肉のエンブラシュアに結び目を置きます。合字を固定するために使用される結び目は、動物を刺激したり、咀嚼を妨げない位置に安全である必要があります。合字を取り付けた後、手術装置からマウスを取り出し、ヒートランプの下できれいなケージに入れ、完全に回復するまで監視してください。
各動物の対象者間のホットガラスビーズ滅菌器の手術器具を殺菌する。適切な環境濃縮を施した各マウスを個別に収容し、7~11日間、温度と湿度制御環境で、フィルター水とマッシュ標準チャウへのアドリビタムアクセスを可能にします。サンプルを収集する準備ができたら、ピペットを使用して、カルシウムとマグネシウムなしで100マイクロリットルの殺菌された摂氏PBSで口腔を10秒間すすぐ。
リンスをさらに2回繰り返し、各リンスを動物ごとに同じ15ミリリットルの円錐形滅菌試験管に入れる。40マイクロメートルのナイロンメッシュフィルターを通して50ミリリットルの円錐チューブに各15ミリリットルチューブの内容物を実行し、濾過物を新しい15ミリリットル試験管に移します。33.3マイクロリットルの16%パラホルムアルデヒドを加え、サンプル固定を容易にします。
すぐにサンプルを渦し、15分間氷の上でそれらをインキュベートします。パラホルムアルデヒドは、プロトコルで採用されている最も危険な試薬であり、製造業者が助言する推奨の個人用保護具で取り扱う必要があります。インキュベーションの後、チューブをPBSで15ミリリットルに充填し、1000xgで遠心分離し、摂氏4度で5分間充填します。
上清を吸引し、4°CでFACSバッファーの1ミリリットルでペレットを再懸濁し、ヘモサイトメーターまたは自動細胞カウンター上の細胞をカウントする。遠心分離を繰り返し、上清を吸引する。次に、FACSバッファーの500、000〜100万の最終濃度のFACSバッファーの適切な体積で細胞ペレットを再中断し、FACSチューブに細胞を移します。
サンプルの50マイクロリットルにラット血清1マイクロリットルと抗マウスIGG抗体の2マイクロリットルを追加します。すぐにサンプルを渦し、20分間氷の上でそれをブロックします。次に、各サンプルに適切な抗体を加えます。
渦と暗闇の中で30分間氷の上でインキュベート。インキュベーション後、サンプルをFACSバッファー1ミリリットル、渦液、遠心分離機を1000xgと摂氏4度で5分間洗浄します。上清をダンプし、FACSチューブの開口部を静かにブロックします。
洗浄を2回繰り返し、保存のために250マイクロリットルのFACSバッファでサンプルを再中断します。パラフィンフィルムでチューブを覆い、アルミホイルで包み、分析する準備ができるまで摂氏4度で保管します。フローサイトメトリーは、ナイーブマウスから経口リンスから回収された好中球、ならびに口腔すすいで、合字誘発性歯肉炎を有するマウスから合字を回収した分析に使用した。
歯槽骨の損失を評価するために、歯槽骨の骨レベルを、肺胞骨の堤から健康で連結したマウスのセメントエナメル接合部まで測定した。次に、測定差を算出した。ここでは検討はしないが、歯角および歯槽骨の組織病理学的、免疫組織化学的、形態評価も研究課題に応じて行うことができる。
このモデルは現在、私の研究室で、経口の自然免疫系が全身の健康と病気に及ぼす影響を研究するために使用されています。
