여기에 설명된 프로토콜은 인간 참가자와 유사한 방식으로 치주 질환의 합자 유도 동물 모델 내에서 경구 호중구를 연구하는 방법을 가진 조사자를 furnishes. 이 기술의 주요 장점은 동물 사용을 감소시키는 후속 분석에 사용할 수있는 염증진 기발 조직의 증가 볼륨에 의해 강조된다. 치아 주변에서 생물막 코팅 합자를 회수하는 능력은 국소화 된 치주 질환의 효과적인 치료를 시뮬레이션 할 수 있습니다.
이 모형의 사용은 염증이 있는 gingival 조직의 증가한 지역 때문에 동물 모형에 있는 치주염의 체계적인 효력의 연구 결과에서 적용될 수 있었습니다. 미세 수술 기구및 해부 현미경의 사용에 익숙해지고, 살아있는 동물 과목을 취급하기 전에 외과 의사의 매듭을 묶는 것은 무겁게 조언됩니다. 이 기술의 시각적 데모는 능숙한 합자 배치를 달성하는 데 필요한 학습 곡선의 길이를 줄이는 데 중요합니다.
절차를 시연하는 것은 제 실험실대학원생인 제프 채드윅이 될 것입니다. 가열 된 수술 플랫폼에 마우스를 배치하여 시작합니다. 마우스가 제대로 마취되도록 한 후 탄성 밴드를 사용하여 열린 위치에서 맥실라와 하악을 안정화시하십시오.
목을 면롤로 프롭하여 맥실라를 수평 자세로 유지하고 몸과 꼬리를 덮어 열 손실을 완화합니다. 구강 위에 원하는 배율 및 조명에 수술 현미경을 배치합니다. 스플린터 집게를 사용하여 Gingival sulcus 내에 M1 및 M2 상악 골어 질 어금니 주위에 멸균 50 또는 작은 편조 실크 봉합사를 설치합니다.
정전의 팔성 측에 봉합사의 탈모꼬리를 배치하고 M2와 M3의 접촉 사이에 근접 세그먼트를 삽입한다. 그런 다음 M2의 부칼 표면을 감싸M1과 M2의 접촉 사이에 삽입합니다. 봉합사의 양쪽 끝이 단단히 당겨져 깅지발 설커스로 운전하십시오. 윤곽높이 아래 M1 주위의 근위 봉합사 세그먼트를 감싸고 M1과 M2의 접촉 사이에 삽입합니다. 봉합사의 근근 꼬리를 단단히 당기면 모든 여유를 제거합니다. 봉합사의 끝을 외과 의사의 매듭으로 묶고 꼬리를 가능한 한 일종의 다듬습니다.
상악 상골 치열의 팔탈 측에 M1과 M2 사이의 칭기질 방출에 매듭을 놓습니다. 합자를 고정하는 데 사용되는 매듭이 안전하고 동물을 자극하거나 매스틱을 방해하지 않는 위치에 있는 것이 중요합니다. 합자 설치 후, 수술 장치에서 마우스를 제거하고 열 램프 아래 깨끗한 케이지에 배치, 완전히 복구 될 때까지 모니터링해야합니다.
각 동물 피사체 사이에 뜨거운 유리 비드 멸균기에서 수술 기구를 살균. 각 마우스를 적절한 환경 농축물로 개별적으로 수용하고 7~11일 동안 온도 및 습도 제어 환경에서 여과된 물과 으깬 표준 차우에 대한 광고 리비툼 액세스를 허용합니다. 샘플을 수집할 준비가 되면 파이펫을 사용하여 칼슘과 마그네슘없이 섭씨 4도의 100 마이크로리터로 구강을 헹구는 데 사용합니다.
헹구기를 두 번 더 반복하여 각 동물에 대해 동일한 15 밀리리터 원미 살균 테스트 튜브에 헹구십시오. 40 마이크로미터 나일론 메쉬 필터를 통해 각 15 밀리리터 튜브의 내용을 50 밀리리터 원내 튜브로 실행하고, 새로운 15 밀리리터 테스트 튜브로 여과물을 전송한다. 시료 고정을 용이하게 하기 위해 16%의 파라포름알데히드의 33.3 마이크로리터를 추가합니다.
샘플을 즉시 소용돌이치고 15 분 동안 얼음에 배양하십시오. Paraformaldehyde는 프로토콜에 사용되는 가장 위험한 시약이며 제조업체가 권고하는 권장 개인 보호 장비로 처리해야합니다. 인큐베이션 후, 튜브를 PBS로 15 밀리리터로 채운 다음 원심분리기는 1000xg, 섭씨 4도에서 5분간 채웁니다.
슈퍼나탈자를 흡습하고, FACS 버퍼 1밀리리터에서 4밀리리터로 펠릿을 다시 중단하고 혈종계 또는 자동 세포 카운터에서 세포를 계산한다. 원심분리를 반복하고 상신을 흡인한다. 이어서, FACS 버퍼의 50마이크로리터당 500, 000~100만 개의 세포의 최종 농도에 대해 적절한 양의 FACS 버퍼로 세포 펠릿을 다시 중단하고 세포를 FACS 튜브로 이송한다.
쥐 혈청 1편과 항마우스 IGG 항체 2마이크로리터를 샘플의 50마이크로리터에 추가합니다. 샘플을 즉시 소용돌이치며 20분 동안 얼음위를 차단합니다. 그런 다음, 각 샘플에 적절한 항체를 추가한다.
소용돌이와 어둠 속에서 30 분 동안 얼음에 배양. 인큐베이션 후, 1밀리리터의 FACS 버퍼, 소용돌이, 원심분리기 1밀리리터로 샘플을 1000xg 및 섭씨 4도에서 5분간 세척합니다. 상체를 덤프하고 FACS 튜브의 개방을 부드럽게 차단합니다.
세척을 두 번 반복한 다음 보관을 위해 FACS 버퍼 250 마이크로리터에서 샘플을 다시 일시 중단합니다. 파라핀 필름으로 튜브를 덮고 알루미늄 호일로 감싸고 분석 할 준비가 될 때까지 섭씨 4도에 보관하십시오. 유동 세포측정은 순진한 마우스로부터 경구 헹구린 에서 회수된 호중구뿐만 아니라 합자 유발 치주염을 가진 마우스로부터 경구 헹구고 회수된 합자를 분석하는 데 사용되었다.
폐포 골 손실을 평가하기 위해, 폐포 골 수준은 건강하고 결찰된 마우스를 위한 cementoenamel 접합에 폐포 뼈 문장에서 측정되었습니다. 그런 다음 측정 차이를 계산했습니다. 여기서 검토되지는 않았지만, 조직병리학, 면역조직화학적, 및 치주및 폐포뼈의 형태성 평가도 연구 질문에 따라 수행될 수 있다.
이 모델은 현재 내 실험실에서 전신 건강과 질병에 대한 경구 선천적 면역 체계의 효과를 연구하는 데 사용되고 있습니다.
