Burada açıklanan protokol, araştırmacılara, ligatür kaynaklı periodontal hastalığın hayvan modeli nde, insan katılımcılara benzer bir şekilde oral nötrofilleri incelemek için bir yöntem sunmaktadır. Bu tekniğin en büyük avantajı, hayvan kullanımını azaltan sonraki analizler için mevcut olan iltihaplı dişeti dokularının artan hacmi ile vurgulanır. Dişlerin çevresinden biyofilm kaplı ligatürler almak için yeteneğimiz lokalize periodontal hastalığın etkili tedavisi simülasyonu sağlar.
Bu modelin kullanımı bir hayvan modelinde periodontitis sistemik etkileri nin çalışmada uygulanabilir, iltihaplı dişeti dokularının artan alanları nedeniyle. Mikrocerrahi aletlerin ve diseksiyon mikroskoplarının kullanımına aşina lık ve canlı hayvan denekleri ele alınmadan önce cerrahın düğümlerini bağlaması çok tavsiye edilir. Bu tekniğin görsel gösterimi, yeterli ligatür yerleşimini elde etmek için gerekli öğrenme eğrisinin uzunluğunu azaltmada çok önemlidir.
Prosedürü gösteren Jeff Chadwig, benim laboratuvarımdan bir yüksek lisans öğrencisi olacak. Fareyi ısıtmalı bir cerrahi platforma yerleştirerek başlayın. Farenin düzgün bir şekilde anestezi altına alınmasını sağladıktan sonra, elastik bantlar kullanarak maksilla ve çene yi açık pozisyonda sabitle.
Yatay bir pozisyonda maksilla korumak ve ısı kaybını azaltmak için vücut ve kuyruk kapağı için bir pamuk rulo ile boyun prop. Cerrahi mikroskobu istenilen büyütme ve aydınlatmaya oral kavite üzerine yerleştirin. Dişeti sulkus içinde M1 ve M2 maksiller molar etrafında steril 50 veya daha küçük örgülü ipek dikiş yüklemek için kıymık forceps kullanın.
Dikişin distal kuyruğunu dişin aldata tarafına yerleştirin ve proksimal segmenti M2 ve M3 teması arasına yerleştirin. Daha sonra, M2'nin bukkal yüzeyinin etrafına sarın ve M1 ve M2'nin teması arasına takın. Dikişin her iki ucunun da dişeti sulkuna doğru sıkıca çekilmesinden emin olun. Proksimal sütür segmentini Kontur yüksekliğinin altında M1'in etrafına sarın ve M1 ve M2'nin teması arasına yerleştirin. Tüm bolluğu gidermek için sütürproksimal kuyruğunu sıkıca çekin. Dikişin uçlarını bir cerrah düğümüile bağlayın ve kuyrukları mümkün olduğunca kırpın.
M1 ve M2 arasındaki diş eti embrasure maksiller dentition palatal tarafında düğüm yerleştirin. Bağın güvenliğini sağlamak için kullanılan düğümün güvenli ve hayvanı tahriş etmeyecek veya mastication'a müdahale etmeyecek konumda olması çok önemlidir. Ligatür kurulumdan sonra fareyi cerrahi cihazdan çıkarın ve ısı lambasının altında temiz bir kafese yerleştirin ve tamamen iyileşene kadar izlediğinizden emin olun.
Her hayvan denek arasında sıcak cam boncuk sterilizatör cerrahi aletleri sterilize. Her fareyi uygun çevresel zenginleştirme ile ayrı ayrı barındırın ve yedi ila 11 gün boyunca sıcaklık ve nem kontrollü bir ortamda filtrelenmiş suya ve püre standart chow'a reklam libitum erişimine izin verin. Numune toplamaya hazır olduğunuzda, 10 saniye boyunca kalsiyum ve magnezyum olmadan sterilize edilmiş dört derece Santigrat PBS 100 mikrolitre ile ağız boşluğu durulama için bir pipet kullanın.
Her bir hayvan için aynı 15 mililitrekonik steril test tüpü içine her durulama yerleştirerek, iki kez daha durulayın. Her 15 mililitrelik tüpün içeriğini 40 mikrometrelik naylon kafes filtresinden 50 mililitrelik konik bir tüpe geçirin ve filtratı yeni bir 15 mililitrelik test tüpüne aktarın. Örnek fiksasyonu kolaylaştırmak için %16 paraformaldehit 33,3 mikrolitre ekleyin.
Örnekleri hemen girdap layın ve 15 dakika boyunca buza koyun. Paraformaldehit protokolde kullanılan en tehlikeli reaktiftir ve üretici tarafından tavsiye edilen kişisel koruyucu ekipmanla birlikte kullanılmalıdır. Kuluçkadan sonra tüpü PBS ile 15 mililitreye doldurun ve 1000xg ve dört santigrat derecede beş dakika santrifüj edin.
Süpernatant aspire, dört santigrat derece FACS tampon bir mililitre pelet yeniden askıya ve bir hemositometre veya otomatik hücre sayacı üzerinde hücreleri saymak. Santrifüjtekrar layın ve supernatant aspire. Daha sonra, 500, 000 ila 1 milyon hücre 50 mikrolitre FACS tampon başına son konsantrasyon için FACS tampon uygun bir hacimde hücre pelet yeniden askıya ve FACS tüpü ne hücreleri aktarın.
Numunenin 50 mikrolitresine bir mikrolitre fare serumu ve iki mikrolitre anti-fare IGG antikor ekleyin. Örneği hemen girvet ve 20 dakika boyunca buzda bloke edin. Daha sonra, her örnek için uygun antikorlar ekleyin.
Girdap ve karanlıkta 30 dakika boyunca buz üzerinde kuluçka. Kuluçkadan sonra, 1000xg ve dört santigrat derece beş dakika boyunca FACS tampon, girdap kısa bir mililitre ile örnekleri yıkayın. Supernatant dökümü ve yavaşça FACS tüpün açılmasını engellemek.
Yıkamayı iki kez tekrarlayın, ardından depolama için 250 mikrolitre FACS arabelleğindeki numuneleri yeniden askıya alın. Parafin film ile tüpler ikap, alüminyum folyo sarın ve analiz etmeye hazır olana kadar dört derece santigrat onları saklayın. Akış sitometrisi, naif bir fareden elde edilen oral durulamadan elde edilen nötrofillerin yanı sıra ligatür kaynaklı periodontitis li bir fareden oral durulama ve kurtarılan ligatür leri analiz etmek için kullanıldı.
Alveoler kemik kaybını değerlendirmek için alveoler kemik düzeyleri alveoler kemik ibik'inden sağlıklı ve ligatlı fareler için setoenamel kavşağa kadar ölçüldü. Daha sonra ölçüm farkları hesaplandı. Burada incelenmemekle birlikte, araştırma sorusuna bağlı olarak periodontium ve alveoler kemiğin histopatolojik, immünohistokimyasal ve morfometrik değerlendirilmesi de yapılabilir.
Bu model şu anda sistemik sağlık ve hastalık üzerinde oral doğuştan bağışıklık sisteminin etkilerini incelemek için benim laboratuvarda kullanılmaktadır.
