Le protocole décrit ici fournit aux investigateurs une méthode pour étudier des neutrophiles oraux dans un modèle animal ligature-induit de la maladie parodontale d’une manière analogue aux participants humains. Le principal avantage de cette technique est mis en évidence par l’augmentation du volume de tissus gingivals enflammés disponibles pour une analyse ultérieure, ce qui réduit l’utilisation des animaux. Notre capacité à récupérer les ligatures recouvertes de biofilms autour des dents permet la simulation d’un traitement efficace d’une maladie parodontale localisée.
L’utilisation de ce modèle pourrait être appliquée dans l’étude des effets systémiques de la parodontite dans un modèle animal, en raison des zones accrues des tissus gingivals enflammés. La familiarisation avec l’utilisation d’instruments microchirurgaux et de microscopes de dissection, ainsi que lier les nœuds du chirurgien avant de manipuler des sujets animaux vivants, est fortement conseillée. La démonstration visuelle de cette technique est essentielle pour réduire la longueur de la courbe d’apprentissage nécessaire pour atteindre le placement de ligature compétent.
Jeff Chadwig, un étudiant diplômé de mon laboratoire, démontrera la procédure. Commencez par positionner la souris sur une plate-forme chirurgicale chauffée. Après avoir assuré que la souris est correctement anesthésiée, stabiliser le maxillaire et la mandibule en position ouverte à l’aide de bandes élastiques.
Prop le cou avec un rouleau de coton pour maintenir le maxillaire dans une position horizontale et couvrir le corps et la queue pour atténuer la perte de chaleur. Placez le microscope chirurgical au grossissement et à l’éclairage désirés au-dessus de la cavité buccale. Utilisez des forceps d’éclat pour installer une suture stérile de soie tressée de 50 ou plus autour des molaires maxillaires M1 et M2 dans le sulcus gingival.
Placez la queue distale de la suture sur le côté palatal de la dentition et insérez le segment proximal entre le contact de M2 et M3. Ensuite, enroulez-le autour de la surface buccale de M2 et insérez-le entre le contact de M1 et M2. Assurez-vous que les deux extrémités de la suture sont bien tirées pour la conduire au sulcus gingival. Enroulez le segment de suture proximale autour de M1 sous sa hauteur de contour et insérez-le entre le contact de M1 et M2. Tirez bien la queue proximale de la suture pour enlever tout relâchement. Attachez les extrémités de la suture avec le nœud d’un chirurgien et coupez les queues le plus tri possible.
Placez le nœud dans l’embrasure gingival entre M1 et M2 sur le côté palatal de la dentition maxillaire. Il est essentiel que le nœud utilisé pour fixer la ligature soit sécurisé et en position où il n’irritera pas l’animal ou n’interférera pas avec la mastication. Après l’installation de ligature, retirez la souris de l’appareil chirurgical et placez-la dans une cage propre sous une lampe thermique, en vous assurant de la surveiller jusqu’à ce qu’elle soit complètement récupérée.
Stériliser les instruments chirurgicaux dans le stérilisateur de perles de verre chaud entre chaque sujet animal. Abritez individuellement chaque souris avec l’enrichissement environnemental approprié et autorisez l’accès ad libitum à l’eau filtrée et à la purée de chow standard dans un environnement contrôlé par la température et l’humidité pendant sept à 11 jours. Lorsque vous êtes prêt à prélever des échantillons, utilisez une pipette pour rincer la cavité buccale avec 100 microlitres de PBS stérilisé de quatre degrés Celsius sans calcium et magnésium pendant 10 secondes.
Répétez le rinçage deux fois de plus, en plaçant chaque rinçage dans le même tube à essai stérile conique de 15 millilitres pour chaque animal. Exécutez le contenu de chaque tube de 15 millilitres à travers un filtre à mailles en nylon de 40 micromètres dans un tube conique de 50 millilitres, et transférez le filtrate dans un nouveau tube à essai de 15 millilitres. Ajouter 33,3 microlitres de 16% de paraformaldéhyde pour faciliter la fixation de l’échantillon.
Vortex les échantillons immédiatement et les incuber sur la glace pendant 15 minutes. Le paraformaldéhyde est le reagent le plus dangereux utilisé dans le protocole et doit être manipulé avec l’équipement de protection individuelle recommandé conseillé par le fabricant. Après l’incubation, remplissez le tube à 15 millilitres de PBS puis centrifugez-le à 1000xg et quatre degrés Celsius pendant cinq minutes.
Aspirez le supernatant, suspendez la pastille en un millilitre de tampon FACS à quatre degrés Celsius et comptez les cellules sur un hémocytomètre ou un compteur de cellules automatisé. Répétez la centrifugation et aspirez le supernatant. Ensuite, suspendez la pastille cellulaire dans un volume approprié de tampon FACS pour une concentration finale de 500 000 à 1 million de cellules par 50 microlitres de tampon FACS et transférez les cellules au tube FACS.
Ajouter un microlitre de sérum de rat et deux microlitres d’anticorps IGG anti-souris à 50 microlitres de l’échantillon. Vortex l’échantillon immédiatement et le bloquer sur la glace pendant 20 minutes. Ensuite, ajoutez les anticorps appropriés à chaque échantillon.
Vortex et incuber sur la glace pendant 30 minutes dans l’obscurité. Après l’incubation, laver les échantillons avec un millilitre de tampon FACS, vortex brièvement, et centrifugeuse pendant cinq minutes à 1000xg et quatre degrés Celsius. Videz le supernatant et bloquez doucement l’ouverture du tube FACS.
Répétez le lavage deux fois, puis suspendez les échantillons dans 250 microlitres de tampon FACS pour le stockage. Couvrir les tubes de film de paraffine, les envelopper dans du papier d’aluminium et les conserver à quatre degrés Celsius jusqu’à ce qu’ils soient prêts à être analysés. La cytométrie d’écoulement a été employée pour analyser des neutrophiles récupérés d’un rinçage oral d’une souris naïve, aussi bien qu’un rinçage oral et la ligature récupérée d’une souris avec la parodontite ligature-induite.
Pour évaluer la perte d’os alvéolaire, des niveaux d’os alvéolaires ont été mesurés de la crête alvéolaire d’os à la jonction de cementoenamel pour les souris saines et ligated. Ensuite, les différences de mesure ont été calculées. Bien qu’il ne soit pas examiné ici, l’évaluation histopathologique, immunohistochimique et morphométrique du parodontium et de l’os alvéolaire peut également être entreprise selon la question de recherche.
Ce modèle est actuellement utilisé dans mon laboratoire pour étudier les effets du système immunitaire oral inné sur la santé systémique et la maladie.
