נמק Myofiber אופייני להפרעות נוירומוסקולריות מרובות וממלא תפקיד מרכזי בפתוגנזה. שיטה ספציפית ואמינה להערכת ניוון שרירים חשובה לאבחון ומחקר תרגום. טכניקה זו מאוד הסתגלות מאפשרת תיוג של אנטיגן מרובים כמו באותו זמן באותו קטע בתוך myofibers.
זה אפשרי עם צבעים חיוניים. כתמי H&E הם שיטות אמפיריות שלא ניתנות להתאמה להדבקה אמינה ותרבה. כתמי ספיגת IgG, לעומת זאת, הוא ספציפי עבור תאי שריר נמק ישים ביופסיות אנושיות.
טכניקה זו יכולה לספק תובנה לתוך כל הפרעות neuromuscular מאופיין myonecrosis. לאחר הסרת השיער מהרגל של עניין מקום חיית mdx זכר בן ארבעה שבועות בתצב supine ולאבטח את הכפות ללוח שעם. באמצעות מספריים מדויקים או ממטרות להסיר את עור הרגל מהרגל אל הברך כדי לחשוף את כל אורך השוקה ו tibialis anterior.
השתמש במספריים כדי להפוך חתך בין השוקה לבין השוקה לפני השוקה. השתמש במטחנים כדי להסיר בזהירות את שכבת האפימיסיום מפני השטח של השריר. בקרסול, השתמש בממטרים כדי לבודד את הגיד לפני השוקיים מהגידים האחרים ולמשוך בעדינות על הגיד כדי לבודד אותו מן השוקה והשרירים שמסביב.
כאשר הבטן לפני השוקית מופרדת לחלוטין להחזיק את הגיד למעלה, כך שרק החלק הפרוקסימלי של השריר לפני השוקית מחובר לברך. ולנתק בעדינות את הגיד הפרוקסימלי קרוב ככל האפשר לפטלה. מניחים את השוקיאליס לפני על חתיכת גזה מעומעמת קלות עם מלוחים כדי למנוע ייבוש.
לטבול חלקית מקור המכיל 70 עד 100 מיליליטר של isopentane לתוך מיכל של חנקן נוזלי עד isopentane בתחתית המקור הופך מוצק לבן. בזהירות תווית הצד השני של הפקקים, כך הביופסיה ניתן לזהות כראוי לאחר ההקפאה, ולהוסיף כ 0.5 מיליליטר של מסטיק tragacanth על 20 על ידי 11 על ידי 8 מילימטר חתיכת פקק עגול. השתמש מטליות כדי להטמיע את השוקיים לפני לתוך צד גיד דיסטלי החניכיים למעלה.
מחזיק את השריר עם הציר שלו בניצב אל משטח הפקק. לפחות מחצית מהצד של הגיד של השוקית anterior צריך להישאר חשוף על ידי המסטיק. לאחר מכן טובלים במהירות את הפקק עם השריר המוטבע לתוך isopentane מקורר, unfrozen במשך כשתי דקות כדי לאפשר הקפאה מלאה.
להשיג חלקים של הרקמה הקפואה, להגדיר את טמפרטורת cryostat למינוס 25 מעלות צלזיוס ולהשתמש תרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית כדי לתקן את הרקמה על בלוק חיתוך קריוסטט. חותכים את הדגימה עד בטן השריר הוא הגיע. השג שבעה עד עשרה מקטעי מיקרומטר שאוספים לפחות שני חלקים לשקופית זכוכית וממקמים את השקופיות בטמפרטורת החדר בזמן שהקטעים נלכדים.
אפשר לרקמות להתייבש לפחות 20 דקות בטמפרטורת החדר בסביבה מאווררת. ואז לאחסן את החלק במינוס 80 מעלות צלזיוס עד שהם מכתימים. אימונולאבל הרקמות.
ראשית, להפשיר את המגלשות בטמפרטורת החדר לפחות 15 דקות בסביבה מאווררת. לאחר מכן, תן את החלקים באמצעות עט הידרופובי. תקן את הרקמות עם 2% paraformaldehyde במשך 10 דקות בתא לח.
בסוף קיבעון לשטוף את החלקים עם שתי 5 דקות שטיפות PBS טרי לכל לשטוף. חסום כל כריכה לא ספציפית עם סרום עיזים 10%מדולל ב- PBS. לאחר שעה בטמפרטורת החדר תווית את החלקים עם נוגדנים ראשוניים של עניין, מדולל 5% סרום עיזים במשך 2 שעות בטמפרטורת החדר.
בסוף הדגירה, לשטוף את המגלשות עם שלוש 5 דקות שטיפות PBS בעקבות תיוג עם נוגדנים משניים פלואורופור המתאים גדוש במשך 45 דקות בטמפרטורת החדר מוגן מפני אור. בסוף הדגירה, לשטוף את השקופיות עם שלוש 10 דקות לשטוף PBS. הר את הקטע עם מדיום הרכבה פלואורסצנטי המכיל 100 ננוגרם למיליליטר של DAPI ותגית כיסוי.
ואז לייבש את המגלשות לילה בארבע מעלות צלזיוס לפני הדמיה. השרירים הראשונים Tibialis מעכברי mdx בן ארבעה שבועות לעתים קרובות להציג פרופילים הטרוגניים כולל אזורים מושפעים קשה באזורים ניוון והתחדשות יחד באותו חתך. אזורי שרירים שאינם מושפעים במקצת מכילים את הגודל והגרעין הגדולים וההומוגניים בצפיפות נמוכה הממוקמים בעיקר בפריפריה או בין myofibers.
IgG חיובי myofibers נעדרים בדרך כלל באזורים בריאותיים כאלה או מושפעים קלות בעוד אימונואקטיביות IgG בתוך myofibers מציין myonecrosis. myofibers שזה עתה נוצרו נמצאים בגודל קטן בשלבים המוקדמים שלהם של התחדשות בהדרגה הגדלת כמו השרירים הצאצאים להתיך לתרום לתא syncytial. במהלך תהליך זה, myonuclei להישאר במרכז הרקמה המתחדשת עם אשכולות של קטנים, מרכזי nucleated myofibers המציין myofibers מחדש לאחרונה כדי למזער את הסיכון של חפצים חשוב לשמור על השרירים ישר בעת הקפאת הרקמה בטמפרטורה הנכונה.
Isopentane ו PFA תמיד צריך להיות מטופלים בזהירות ותחת מכסה המנוע אדים.
