Miyofiber nekroz birden fazla nöromüsküler bozukluğun karakteristik özelliğidir ve patogenezde merkezi bir rol oynar. Kas dejenerasyonu değerlendirmek için özel, güvenilir bir yöntem tanı ve çeviri araştırma için önemlidir. Bu son derece uyarlanabilir teknik, aynı bölümde birden fazla antijenin miyofiberler içinde aynı anda etiketlemesine olanak sağlar.
Hayati boyalarla mümkündür. H&E boyama, güvenilir ve tekrarlanabilir çekim için uyarlanamayan ampirik bir yöntemdir. IgG alımı boyama, ancak, nekrotik kas hücreleri için özel ve insan biyopsileri için geçerlidir.
Bu teknik mionekroz ile karakterize tüm nöromüsküler bozukluklar içine anlayış sağlayabilir. İlgi ayağından saç çıkardıktan sonra supine pozisyonda dört haftalık erkek mdx hayvan yerleştirin ve bir mantar tahtası pençeleri güvenli. Hassas makas veya forceps kullanarak tibia ve tibialis anterior tüm uzunluğu ortaya çıkarmak için diz ayak bacak deri sini çıkarın.
Tibia ve tibialis anterior arasında bir kesi yapmak için makas kullanın. Dikkatle kas yüzeyinden epimysium tabakası kaldırmak için forceps kullanın. Ayak bileğinde, diğer tendondan tibialis anterior tendonu izole etmek için forceps kullanın ve yavaşça tibia ve çevresindeki kaslardan izole etmek için tendon yukarı çekin.
Tibialis anterior göbek tamamen böylece tibialis anterior kas sadece proksimal kısmı diz bağlı olarak tendonu tutun ayrılmış zaman. Ve proksimal tendonu patella ya kadar yakın yavaşça ayırın. Kurumasını önlemek için hafifçe tuzlu ile nemlendirilmiş gazlı bez bir parça tibialis anterior yerleştirin.
Kabın altındaki isopentane beyaz bir katı haline gelene kadar sıvı nitrojen bir kap içine isopentane 70 ila 100 mililitre içeren bir kabı kısmen batırın. Biyopsi donduktan sonra düzgün bir şekilde tespit edilebilsin diye mantarların diğer tarafını dikkatlice etiketlendirin ve yaklaşık 0,5 mililitre tragacanth sakızı ekleyin ve 20'ye 11'e 8 milimetrelik dairesel bir mantar parçasına ekleyin. Kadar sakız distal tendon tarafına tibialis anterior gömmek için forceps kullanın.
Mantar yüzeyine dik ekseni ile kas tutma. Tibialis anterior tendon tarafının en az yarısı sakız tarafından ortaya kalmalıdır. Sonra hızlı bir şekilde soğutulmuş içine gömülü kas ile mantar daldırma, dondurulmamış tam dondurma sağlamak için yaklaşık iki dakika boyunca isopentane.
Dondurulmuş doku bölümlerini elde edin, kriyostat sıcaklığını eksi 25 dereceye ayarlayın ve dokuyu kriyostat kesme bloğuna sabitlemek için optimum kesme sıcaklığı bileşiği kullanın. Kas karın ulaşılından önce örnek trim. Bölümler yakalanırken slaytları oda sıcaklığında yerleştirerek cam slayt başına en az iki bölüm toplayan 7 ila 10 mikrometre lik kesitler edinin.
Havalandırmalı bir ortamda oda sıcaklığında en az 20 dakika boyunca dokuların kurumasını bekleyin. Sonra bölümü lekeleyene kadar eksi 80 derecede saklayın. Dokuları immunolabel.
İlk olarak, havalandırılan ortamda en az 15 dakika oda sıcaklığında slaytları eritin. Daha sonra, hidrofobik kalem ile bölümleri belirtin. Nemli bir odada 10 dakika boyunca% 2 paraformaldehit ile dokuları düzeltin.
Bir fiksasyon sonunda yıkama başına taze PBS iki 5 dakika yıkar ile bölümleri durulayın. PBS'de seyreltilmiş %10 keçi serumu ile spesifik olmayan herhangi bir bağlanmayı engelleyin. Oda sıcaklığında 1 saat sonra ilgi birincil antikorları ile bölümleri etiket, oda sıcaklığında 2 saat boyunca% 5 keçi serum seyreltilmiş.
Kuluçka sonunda, PBS'de üç 5 dakikalık yıkayıcı slaytları durulayın ve ardından ışıktan korunan oda sıcaklığında 45 dakika boyunca uygun florofor konjuge ikincil antikorlarla etiketleyin. Kuluçka sonunda, PBS üç 10 dakikalık yıkar ile slaytlar yıkayın. DaPI mililitre başına 100 nanogram ve bir kapak kayma içeren bir floresan montaj ortamı ile bölüm monte.
Daha sonra görüntülemeden önce slaytları bir gecede dört derece santigrat derecede kurutun. Dört haftalık mdx farelertibialis anterior kasları genellikle aynı kesitte birlikte dejeneratif ve rejeneratif alanlarda kötü etkilenen alanlar da dahil olmak üzere heterojen profiller görüntüler. Hafif etkilenen kas bölgelerinde etkilenmemiş esas olarak çevre de veya miyofiller arasında bulunan düşük yoğunluklu büyük ve homojen boyutu ve çekirdekleri miyofibers içerir.
Miyofiberler içinde IgG immünoaktivite mionekrosisgösterir ise IgG pozitif miyofiberler genellikle bu tür sağlık veya hafif etkilenen bölgelerde yok. Yeni oluşan miyolifler, kas atalarının sinsel hücreye katkıda bulunmasıyla yenilenmenin erken evrelerinde küçük bir boyutta bulunurlar. Bu işlem sırasında, miyokenin küçük kümeleri ile rejenerasyon doku merkezinde kalır, merkezi olarak çekirdekli miyofiberler son zamanlarda yenilenmiş miyofiberler gösteren bu doku dondurma ve doğru sıcaklıkta kaslarda düz tutmak önemlidir.
Isopentane ve PFA her zaman dikkatli ve bir duman başlık altında ele alınmalıdır.
