Некроз миофибера характерен для множественных нервно-мышечных расстройств и играет центральную роль в патогенезе. Специфический, надежный метод оценки мышечной дегенерации имеет важное значение для диагностики и трансляционных исследований. Этот чрезвычайно адаптируемый метод позволяет маркировки нескольких антигенов, как то же время в том же разделе в том, что myofibers.
Это возможно с жизненно важными красителями. Окрашивание Н И Е является эмпирическим методом, который не адаптируется для надежного и воспроизводимого спряжения. IgG поглощения окрашивания, однако, специфичен для некротических мышечных клеток и применимы к биопсии человека.
Этот метод может дать представление о всех нервно-мышечных расстройств характеризуется мионекроза. После удаления волос с ноги интерес место четырехнедельный мужчина mdx животных в положении на спине и обеспечить лапы пробки борту. Используя высокоточные ножницы или типсы удалить кожу ноги от ноги до колена, чтобы разоблачить всю длину голени и голени передней.
Используйте ножницы, чтобы сделать разрез между голени и голени передней. Используйте типсы, чтобы тщательно удалить слой эпимизия с поверхности мышцы. На лодыжке, использовать миппы, чтобы изолировать переднее сухожилие голени от других сухожилий и осторожно подтянуть на сухожилие, чтобы изолировать его от голени и окружающих мышц.
Когда tibialis передней части живота полностью отделены провести сухожилия так, что только проксимальная часть голени передней мышцы прилагается к колену. И аккуратно разорвать проксимальное сухожилие как можно ближе к коленной чашечке. Поместите tibialis передней на кусок марли слегка смоченной солевым раствором, чтобы избежать высыхания.
Частично окуните стакан, содержащий от 70 до 100 миллилитров изопентанов, в контейнер с жидким азотом до тех пор, пока изопентан на дне стакана не станет белым твердым. Тщательно предварительно обозначить другую сторону пробки, так что биопсия может быть правильно определены после замораживания, и добавить примерно 0,5 миллилитров трагакантовой резинки на 20 на 11 на 8 миллиметров круговой кусок пробки. Используйте типсы для встраивания голени передней в десен дистального сухожилия вверх.
Удерживая мышцу своей оси перпендикулярно поверхности пробки. По крайней мере половина сухожилия стороне голени передней должны оставаться обнаружены резинки. Затем быстро окунуть пробку со встроенной мышцы в охлажденный, размороженный изопентан в течение примерно двух минут, чтобы обеспечить полное замораживание.
Получить разделы замороженных тканей, установить температуру криостата до минус 25 градусов по Цельсию и использовать оптимальное соединение температуры резки, чтобы исправить ткани на криостат резки блока. Обрежьте образец до тех пор, пока мышечный живот не будет достигнут. Получить от семи до 10 микрометров разделов сбора по крайней мере две секции на стеклянную горку размещения слайдов при комнатной температуре, как разделы захвачены.
Разрешить ткани высохнуть, по крайней мере 20 минут при комнатной температуре в проветриваемой среде. Затем храните раздел при температуре минус 80 градусов по Цельсию, пока они не окрашивают. Иммунолабель тканей.
Во-первых, оттаивать горки при комнатной температуре не менее 15 минут в проветриваемой среде. Далее очерчиваем секции гидрофобной ручкой. Исправить ткани с 2%paraformaldehyde в течение 10 минут во влажной камере.
В конце фиксации промыть секции с двумя 5 минут моет в свежем PBS за стирку. Блокируйте любую неспецифическую привязку с 10%goat сывороткой, разбавленной в PBS. Через 1 час при комнатной температуре этикетку секций с первичными антителами, представляющими интерес, разбавляют в 5%козлиной сыворотке в течение 2 часов при комнатной температуре.
В конце инкубации, промыть слайды с тремя 5 минут моет в PBS следовать маркировки с соответствующим флюорофором конъюгированных вторичных антител в течение 45 минут при комнатной температуре защищены от света. В конце инкубации, мыть горки с тремя 10 минут моет в PBS. Намонтировать секцию с флуоресцентной крепления среды, содержащей 100 нанограмм на миллилитр DAPI и крышка скольжения.
Затем высушите горки на ночь при четырех градусах цельсия перед визуализацией. Tibialis передние мышцы из четырех недель mdx мышей часто отображают неоднородные профили в том числе плохо пострадавших районах в вырождающихся и регенерирующих областях вместе в том же поперечном сечении. Не затронутые слегка пораженные мышечные области содержат миофиберы большого и однородного размера и ядра при низкой плотности, которые в основном расположены на периферии или между миофиберами.
IgG положительные миофиберы, как правило, отсутствуют в таком здоровье или слегка пострадавших районах в то время как IgG иммунореактивности в миофиберов указывает на мионекроз. Недавно сформированные миофиберы присутствуют на небольших размерах на ранних стадиях регенерации, постепенно увеличиваясь по мере того, как мышечные прародители сливаются в синцитиальной клетке. Во время этого процесса, myonuclei остаются в центре регенерирующих тканей с кластерами малых, централизованно nucleated миофиберов, указывающих недавно регенерированных миофиберов, чтобы свести к минимуму риск артефактов важно держать в мышцах прямо при замораживании ткани и при правильной температуре.
Isopentane и PFA всегда должны быть обработаны с осторожностью и под капотом дыма.
