肌肉活检中的免疫标记肌纤维退化

Myofiber 坏死是多种神经肌肉疾病的特征，在发病机制中起着核心作用。评估肌肉退化的一种具体、可靠的方法对于诊断和转化研究非常重要。这种极其适应性强的技术允许在同一部分中同时标记多个抗原。

这是有可能与重要的染料。H&E 染色是一种经验方法，不能适应可靠和可重复的结合。然而，IgG吸收染色是特异性坏死肌肉细胞，适用于人类活检。

这种技术可以提供洞察所有神经肌肉疾病的特点是 myonecrosis 。从感兴趣的腿上取下头发后，将四周大的雄性 mdx 动物放在上角位置，将爪子固定到软木板上。使用精密剪刀或钳子将腿部皮肤从脚到膝盖去除，以暴露头骨和头骨前部的整个长度。

使用剪刀在头骨和头骨前做切口。使用钳子小心地从肌肉表面去除表皮层。在脚踝，使用钳子将头骨前肌腱与其他肌腱分离，然后轻轻地拉上肌腱，将其与头骨和周围肌肉隔离。

当头骨前腹部完全分离时，将肌腱向上，使只有头骨前肌的近部部分附着在膝盖上。轻轻地切断近向肌腱尽可能接近的帕泰拉。将头骨放在用盐水轻轻打湿的纱布上，以避免干燥。

将含有70至100毫升异丙烷的烧杯部分浸入液氮容器中，直到烧杯底部的异丙烷变成白色固体。仔细预先标记软木塞的另一侧，以便冷冻后能正确识别活检，并在 20 比 11 到 8 毫米圆形软木塞上添加约 0.5 毫升的曲糖胶。使用钳子将牙龈前肌嵌入牙龈肌腱侧向上。

用垂直于软木表面的轴抓住肌肉。牙龈前部至少一半的肌腱侧应保持未被牙龈覆盖。然后迅速将软木塞与嵌入的肌肉浸入冷藏、未冻结的异丙烷中约两分钟，以便完全冻结。

获取冷冻组织部分，将低温温度设置为零下 25 摄氏度，并使用最佳切割温度化合物将组织固定到低温热器切割块上。修剪样品，直到达到肌肉腹部。获取 7 到 10 微米部分，收集每个玻璃幻灯片至少两个节，在捕获这些部分时将幻灯片置于室温下。

在通风环境中，让组织在室温下干燥至少 20 分钟。然后将部分储存在零下 80 摄氏度，直到它们染色。免疫标签组织。

首先，在室温下在通风环境中解冻幻灯片至少15分钟。接下来，使用疏水笔描绘各部分。在潮湿的腔室中用2%的甲醛固定组织10分钟。

在固定结束时，每次洗涤用两次 5 分钟洗涤，冲洗部分。用在PBS中稀释的10%山羊血清阻止任何非特异性结合。室温1小时后，用感兴趣的原抗体标记各部分，在室温下在5%山羊血清中稀释2小时。

在孵育结束时，在PBS中用3个5分钟的洗涤液冲洗幻灯片，然后用适当的荧光结合二次抗体标记，在室温下保持45分钟，防止光线。在孵育结束时，用三次10分钟的PBS洗涤滑梯。使用荧光安装介质安装该部分，该介质包含每毫升 DAPI 100 毫微克和盖滑。

然后在成像前将幻灯片在摄氏四度下干燥。来自四周大 mdx 小鼠的 Tibialis 前肌肉通常显示异质轮廓，包括在同一横截面中退化和再生区域影响不佳的区域。不受轻度影响肌肉区域的影响，含有大而均匀的肌黄体，低密度的核主要位于边缘或肌骨之间。

IgG阳性 myofibers 在此类健康或轻度受影响的区域通常不存在，而 Iofibers 内的 IgG 免疫反应性表示 myofibers。新形成的肌纤维在再生的早期阶段以小尺寸存在，随着肌肉祖细胞的融合，逐渐扩大，从而有助于同步细胞。在这个过程中，肌黄体留在再生组织的中心，有一簇小的，集中核的肌黄玉，指示最近再生的肌黄体，为了尽量减少神器的风险，重要的是保持肌肉直，当冻结组织和在正确的温度。

异丙烷和PFA应始终小心处理，并在烟罩下处理。