פרוטוקול זה מאפשר נוקאאוטים מהירים וחודרים מאוד של גנים מוגבלים בחלל בתאי גזע עצביים של חוט השדרה אקסוטול לחקר המנגנונים המולקולריים של התחדשות חוט השדרה. טכניקה זו מאפשרת לחקור את תפקוד הגנים בתאי גזע עצביים, התחדשותו הרפואית מבלי להיות מבולבל על ידי השפעות התפתחותיות או השפעות מסוגי תאים אחרים. תאי גזע עצביים אקסואולוטליים תורמים במידה רבה ליכולתם לחדש את חוטי השדרה שלהם.
הבנת מנגנוני התחדשות יכולה להוביל לתובנות לפיתוח טיפולים לפגיעה בחוט השדרה האנושי. שיטה זו מספקת תובנה כיצד תאי גזע עצביים axolotl לעלות תגובה רגנרטיבית לפגיעה בחוט השדרה. מיקום נכון של נימי ההזרקה בעמוד המרכזי של חוט השדרה יכול להיות מאתגר ותרגול על חיות מבחן עוזר עם השליטה בטכניקה.
צפייה בממשל יכולה להראות כיצד לבצע את ההזרקה ואיך נראית זריקה מוצלחת. כדי להכין את תערובת החלבון הריבונוקלארית של מדריך Cas9, יש לערבב חמישה מיקרוגרם של חלבון רצף לוקליזציה גרעינית Cas9, ארבעה מיקרוגרם של RNA מנחה ו-0.9 מיקרוליטרים של מאגר Cas9X 10X. לאחר מכן להביא את הנפח הכולל ל 10 microliters עם מים ללא גרעין ולאחסן את המדריך Cas9 RNA תערובת חלבון ריבונוקלארי במינוס 80 מעלות צלזיוס אם לא נעשה שימוש מיידי.
להכנת צלחת אלקטרופורציה אגרוז, להכין 200 מיליליטר של 2% agarose ב PBS של Dulbecco ולהמיס את התערובת במיקרוגל. לאחר קירור קל, יוצקים את הנוזל לתוך 10 ס"מ צלחות פטרי לעומק של כ 10 מילימטרים ולאפשר את הצלחות להתגבש בטמפרטורת החדר. כאשר ההתעוררות מוצקה למגע, השתמש באזמל כירורגי כדי לחתוך חריץ בהתעוררות של כל מנה להחזקת הזנב ישר, באר שתתאים לגוף החיה, ושתי בארות נוספות להחזיק את האלקטרודות.
לאחר מכן מניחים את הצלחות על קרח וממלאים אותן לקצה עם DPBS קר כקרח. כדי להגדיר את האלקטרופורטור, הגדר את פעימת הנקבוביות לפעימה דו קוטבית אחת ב 70 וולט עם משך של חמש אלפיות שנייה, מרווח של 50 אלפיות שנייה, וללא ריקבון מתח. הגדר את פעימת ההעברה לארבעה פולסים דו-קוטביים של 40 וולט עם משך של 50 אלפיות שניה, מרווח של 999 אלפיות שניה וריקבון מתח של 10%.
לאחר מכן חבר את האלקטרודות לאלקטרופורטור והתאם את פינצטה כך שהם יהיו שבעה מילימטרים זה מזה לפני שהם טובלים את האלקטרודות בצופה של PBS. כדי להכין נימים מיקרו הזרקת זכוכית, לבצע בדיקת רמפה על מושך micropipette לפי הוראות היצרן כדי לקבוע את ערך החום. ואז למשוך נימים הזרקת עם קצוות מחודדים עם הפרמטרים שצוינו.
לאחר משיכה, השתמש במיקרוסקופ סטריאו ומדפים עדין כדי לשבור את נימי בזווית, כך שיש לו קצה מלוכסן בעמדה שבה הקצה דק מספיק כדי למקד את התעלה המרכזית של עמוד השדרה האקסוטול תוך שמירה חזקה מספיק כדי לנקב את העור. לפני טעינת הקצה, מוסיפים תמיסת FCF ירוקה מהירה לתערובת החלבון הריבונוקלארי ביחס של 1 עד 30 ולהשתמש בקצה פיפטה לטעינת ג'ל כדי לטעון כ-5 מיקרוליטרים של תערובת ההזרקה לתוך נימי. לאחר מכן הר את נימי על המשאבה פנאומטי עם קצה מלוכסן פונה כלפי מטה.
כדי להגדיר את המשאבה הפנאומטית, הגדר את ההחזקה ל-0.5 פאונד לאינץ' מרובע, את הפליטה לשתי פאונד לאינץ' מרובע ואת משך הזמן ל- gated. כדי לבדוק את הגדרות נימי ומשאבה, לטבול את נימי לתוך טיפת מים ולחץ על דוושת כף הרגל כדי להזריק. תערובת ההזרקה צריכה לצאת בזרם איטי אך יציב.
כדי להזריק את תערובת החלבון ribonuclear, להפוך את axolotls להיות מוזרק במהופך במים כדי לאשר את sedation ולהשתמש מטליות טבעת להעביר חיה אחת על מצע של סיליקון עם הצד השמאלי של החיה פונה כלפי מעלה והזנב מצביע ימינה. מקם את אתר ההזרקה באמצע שדה המבט של מיקרוסקופ הסטריאו והתאם את המיקרומניפולטור כך שהניפי ייכנס לחיה בזווית של 60 מעלות מהצד הימני של שדה המבט. לאחר זיהוי חוט השדרה והתעלה המרכזית, הזז באיטיות את נימי לכיוון התעלה המרכזית של חוט השדרה עד שהוא חודר בעדינות את העור והשריר.
כאשר נימי הוא בעמדה, לחץ והחזק את דוושת הרגל כדי להזריק את התערובת לתוך התעלה המרכזית. אם נימי הונח כראוי, תערובת החלבון ribonuclear יתפשט לאורך התעלה המרכזית כמו קו כחול בשני הכיוונים. זה יכול להיות מאתגר למקם את נימי כראוי.
אם התערובת אינה מתפשטת כראוי, התאימו את מיקום נימי בצעדים קטנים תוך שמירה על משטח כף הרגל לחוץ. ממשיכים להחזיק את דוושת כף הרגל עד שהתערובת מגיעה לווסיל המסוף בקצה חוט השדרה ובחיוכים במוח. ייתכן שיהיה צורך להתאים את לחץ הפליטה במהלך ההזרקה.
מיד לאחר ההזרקה, השתמש במלקחיים טבעתיים כדי להעביר את החיה אל צלחת האלקטרופוריה המוכנה על הקרח ולהציב את הזנב בתוך חריץ, כך שהוא דחוק על ידי אגרוז. מניחים את האלקטרודות לתוך בארות משני צידי הזנב, דואג כי החיה כולה אלקטרודות מכוסים על ידי PBS קר כקרח ולחץ על מתג הרגל כדי להתחיל את האלקטרופוזיה. ואז להחזיר את החיה למים עם ניטור עד החלמה מלאה ולהזריק אלקטרופולאט בעלי החיים הבאים באותו אופן.
כדי להעריך את היעילות של הנוקאאוט ברמת החלבון, להשיג חתך רוחב של הזנב ולבצע ניתוח אימונוהיסטוכימי על פי פרוטוקולים סטנדרטיים. לחלופין, לחלץ את חוט השדרה אלקטרופולד lyse את הדגימה כדי להשיג את ה-DNA. לאחר מכן לבצע PCR genotyping ואחריו רצף סנגר או רצף הדור הבא כדי להעריך את אחוז loci גנטי ערוך.
הזרקת אלקטרופוזיה של מתחמי RNA מדריך Cas9 נגד Sox2 לתוך התעלה המרכזית של חוט השדרה axolotl מוביל לאובדן מסיבי של אימונואקטיביות Sox2 ברוב תאי גזע עצביים חוט השדרה השווה את הזריקה ואת אלקטרופורציה של מתחמי RNA מדריך Cas9 נגד טירוזינאז כפקד. כימות של תאים חיוביים Sox2 בדגימות רקמת חוט השדרה מגלה מספר מופחת באופן משמעותי של תאים מבטאים Sox2 ב Cas9 Sox2 מדריך RNA אלקטרופוזיה נוקאאוט בעלי חיים, המציין כי שיטה זו מובילה יעיל מאוד חודר נוקאאוט גנים בתאי גזע עצביים חוט השדרה. לאחר הזרקה בו זמנית electroporation של שני מתחמי RNA מדריך Cas9 נגד Sox2 ו GFP לתוך axolotls מהופנט עם ביטוי GFP בכל מקום, אחוז גבוה של תאי גזע עצביים נוקאאוט כפול נצפתה, המציין כי הפרוטוקול יכול לשמש כדי לדפוק בגמישות גנים מרובים.
מומלץ לתרגל מיקוד התעלה המרכזית עם נימי ולשים נוסחה עם שלבי פתרון הבעיות כאשר ההזרקה אינה פועלת כצפוי. טכניקה זו מאפשרת לחוקרים לחקור את הפונקציות של גנים בתאי גזע עצביים הספציפיים להתחדשות. יש לדאוג בעת מניפולציה נימי ולוודא לא דוקר את האצבעות שלך.
