Questo protocollo consente di eliminare il tempo rapido e altamente penetrante e il gene a limiti di spazio nelle cellule staminali neurali del midollo spinale axolotl per lo studio dei meccanismi molecolari della rigenerazione del midollo spinale. Questa tecnica consente lo studio della funzione genica nelle cellule staminali neurali, la sua rigenerazione medica senza essere confusa da effetti di sviluppo o effetti di altri tipi di cellule. Le cellule staminali neurali axolotl contribuiscono in gran parte alla loro capacità di rigenerare il midollo spinale.
Comprendere i meccanismi di rigenerazione potrebbe portare a approfondimenti per lo sviluppo di trattamenti per lesioni del midollo spinale umano. Questo metodo fornisce informazioni su come le cellule staminali neurali axolotl montano una risposta rigenerativa alla lesione del midollo spinale. Posizionare correttamente il capillare di iniezione nella colonna centrale del midollo spinale può essere impegnativo e praticare sugli animali da test aiuta a padroneggiare la tecnica.
La visualizzazione dell'amministrazione può mostrare come eseguire l'iniezione e come appare un'iniezione riuscita. Per preparare la miscela di proteine ribonucleari RNA guida Cas9, mescolare cinque microgrammi di proteina della sequenza di localizzazione nucleare Cas9, quattro microgrammi di RNA guida e 0,9 microlitri di tampone Cas9 10X. Quindi portare il volume totale a 10 microlitri con acqua priva di nucleasi e conservare la miscela di proteine ribonucleari RNA guida Cas9 a meno 80 gradi Celsius se non utilizzata immediatamente.
Per la preparazione della piastra di elettroporazione dell'agarosio, preparare 200 millilitri di 2%agarosio nel PBS di Dulbecco e sciogliere la miscela in un forno a microonde. Dopo un leggero raffreddamento, versare l'agarosio liquido in piastre di Petri di 10 centimetri a una profondità di circa 10 millimetri e lasciare che le piastre si solidificheranno a temperatura ambiente. Quando l'agarosio è sodo al tatto, usa un bisturi chirurgico per tagliare una fessura nell'agarosio di ogni piatto per tenere la coda dritta, un pozzo adatto al corpo dell'animale e due pozzali extra per tenere gli elettrodi.
Quindi posizionare le piastre sul ghiaccio e riempirle sul bordo con DPBS ghiacciato. Per configurare l'elettroporatore, impostare l'impulso poring su un impulso bipolare a 70 volt con una durata di cinque millisecondi, un intervallo di 50 millisecondi e nessun decadimento della tensione. Impostare l'impulso di trasferimento su quattro impulsi bipolari di 40 volt con una durata di 50 millisecondi, un intervallo di 999 millisecondi e un decadimento della tensione del 10%.
Quindi collegare gli elettrodi all'elettroporatore e regolare le pinzette in modo che siano distanti sette millimetri prima di immergere gli elettrodi in un becher di PBS. Per preparare capillari di micro-iniezione di vetro, eseguire un test di rampa su un estrattore di micropipette secondo le istruzioni del produttore per determinare il valore del calore. Quindi tirare i capillari di iniezione con estremità affusolata con i parametri indicati.
Dopo aver tirato, utilizzare un microscopio stereo e forceps fini per rompere il capillare ad angolo in modo che abbia una punta inclinata in una posizione in cui la punta è abbastanza sottile da colpire il canale centrale della colonna vertebrale axolotl pur rimanendo abbastanza forte da perforare la pelle. Prima di caricare la punta, aggiungere una soluzione FCF verde veloce alla miscela proteica ribonucleare con un rapporto uno a 30 e utilizzare una punta di pipetta a caricamento gel per caricare circa cinque microlitri della miscela di iniezione nel capillare. Quindi montare il capillare sulla pompa pneumatica con la punta inclinata rivolta verso il basso.
Per configurare la pompa pneumatica, impostare la presa su 0,5 libbre per pollice quadrato, l'espulsione su due libbre per pollice quadrato e la durata da recintare. Per testare le impostazioni capillare e della pompa, immergere il capillare in una goccia d'acqua e premere il pedale per iniettare. Il mix di iniezione dovrebbe uscire in un flusso lento ma costante.
Per iniettare la miscela proteica ribonucleare, capovolgere gli assoloni da iniettare a testa in giù nell'acqua per confermare la sedazione e utilizzare le forcette ad anello per trasferire un animale su un letto di silicone con il lato sinistro dell'animale rivolto verso l'alto e la coda rivolta a destra. Posizionare il sito di iniezione al centro del campo visivo del microscopio stereo e regolare il micromanipolatore in modo che il capillare entri nell'animale con un angolo di 60 gradi dal lato destro del campo visivo. Dopo aver identificato il midollo spinale e il canale centrale, spostare lentamente il capillare verso il canale centrale del midollo spinale fino a quando non perfora delicatamente la pelle e il muscolo.
Quando il capillare è in posizione, premere e tenere premuto il pedale per iniettare la miscela nel canale centrale. Se il capillare è stato posizionato correttamente, la miscela di proteine ribonucleari si diffonderà lungo il canale centrale come linea blu in entrambe le direzioni. Può essere difficile posizionare correttamente il capillare.
Se la miscela non si diffonde correttamente, regolare la posizione capillare a piccoli passi mantenendo premuto il pedino. Continuare a tenere premuto il pedale fino a quando la miscela raggiunge la vescicola terminale alla fine del midollo spinale e i ventricoli nel cervello. Potrebbe essere necessario regolare la pressione di espulsione durante l'iniezione.
Immediatamente dopo l'iniezione, utilizzare le forcette ad anello per trasferire l'animale sulla piastra di elettroporazione dell'agarosio preparata sul ghiaccio e posizionare la coda all'interno della fessura in modo che sia inserita dall'agarosio. Posizionare gli elettrodi nei pozzi su entrambi i lati della coda, facendo attenzione che l'intero animale e gli elettrodi siano coperti da PBS ghiacciato e premere l'interruttore del piede per avviare l'elettroporazione. Quindi riportare l'animale in acqua con monitoraggio fino al pieno recupero e iniettare ed elettroporare gli animali successivi allo stesso modo.
Per valutare l'efficienza del knock-out a livello proteico, ottenere una sezione trasversale della coda ed eseguire analisi immunoistochimiche secondo protocolli standard. In alternativa, estrarre il midollo spinale elettroporato e llyse il campione per ottenere il DNA. Quindi eseguire la PCR genotipizzazione seguita dal sequenziamento Sanger o dal sequenziamento di nuova generazione per valutare la percentuale di loci genetici modificati.
L'iniezione e l'elettroporazione dei complessi di RNA guida Cas9 contro Sox2 nel canale centrale del midollo spinale axolotl porta a una massiccia perdita di immunoreattività sox2 nella maggior parte delle cellule staminali neurali del midollo spinale rispetto all'iniezione e all'elettroporazione dei complessi di RNA guida Cas9 contro la tirosinasi come controllo. La quantificazione delle cellule sox2-positive nei campioni di sezione del tessuto del midollo spinale rivela un numero significativamente ridotto di cellule che esprimono Sox2 negli animali knock-out di elettroporazione dell'RNA guida Cas9 Sox2, indicando che questo metodo porta a un knock-out genico efficiente e altamente penetrante nelle cellule staminali neurali del midollo spinale. Dopo l'iniezione simultanea e l'elettroporazione di due complessi di RNA guida Cas9 contro Sox2 e GFP in axolotl transgenici con espressione onnipresente GFP, si osserva un'alta percentuale di cellule staminali neurali a doppio knock-out, indicando che il protocollo può essere utilizzato per eliminare in modo flessibile più geni.
È utile esercitarsi a prendere di mira il canale centrale con un capillare e indossare una formula con le fasi di risoluzione dei problemi per quando l'iniezione non funziona come previsto. Questa tecnica consente ai ricercatori di studiare le funzioni dei geni nelle cellule staminali neurali che sono specifici per la rigenerazione. Fai attenzione quando manipoli il capillare e assicurati di non pugnalare le tue dita.
