Bu protokol, omurilik rejenerasyonunun moleküler mekanizmalarının incelenmesi için axolotl spinal kord sinir kök hücrelerinde hızlı ve yüksek nüfuz lu zaman ve uzay kısıtlamalı gen nakavtları sağlar. Bu teknik, nöral kök hücrelerde gen fonksiyonunun incelenmesini, diğer hücre tiplerinden gelen gelişimsel etkiler veya etkilerle şaşkına girmeden tıbbi yenilenmesine olanak sağlar. Axolotl nöral kök hücreler omuriliklerini yenileme yeteneklerine büyük ölçüde katkıda bulunurlar.
Rejenerasyon mekanizmaları anlamak insan omurilik yaralanması için tedavi geliştirmek için anlayışlar yol açabilir. Bu yöntem, axolotl nöral kök hücrelerin omurilik yaralanmasına karşı rejeneratif bir yanıt ı nasıl monte ettiğine dair içgörü sağlar. Enjeksiyon kılcal damarını omurilik merkezi kolona doğru konumlandırmak zor olabilir ve test hayvanları üzerinde pratik yapmak teknikte ustalaşmaya yardımcı olur.
Yönetimi görüntülemek nasıl enjeksiyon gerçekleştirmek ve başarılı bir enjeksiyon gibi görünüyor gösterebilir. Cas9 kılavuzu RNA ribonnükleer protein karışımını hazırlamak için beş mikrogram Cas9 nükleer lokalizasyon sırası proteini, dört mikrogram kılavuz RNA ve 0,9 mikrolitre 10X Cas9 tamponunu karıştırın. Daha sonra çekirdeksiz su ile 10 mikrolitreye toplam hacmi getirin ve hemen kullanılmadığı takdirde Cas9 kılavuzu RNA ribonnükleer protein karışımını eksi 80 santigrat derecede saklayın.
Agarose elektroporasyon plakası hazırlama için, Dulbecco'nun PBS'inde %2 agarose 200 mililitre hazırlayın ve karışımı mikrodalgafırında çözün. Hafif bir soğuğa girdikten sonra, sıvı agarose'u 10 santimetrelik Petri tabaklarına yaklaşık 10 milimetre derinliğe dökün ve tabakların oda sıcaklığında katılaşmasını bekleyin. Agarose dokunmak için sağlam olduğunda, kuyruk düz tutmak için her yemeğin agarose bir yarık kesmek için bir cerrahi neşter kullanın, hayvanın vücuduna uyacak bir kuyu, ve elektrotlar tutmak için iki ekstra kuyu.
Daha sonra plakaları buz üzerine yerleştirin ve buz gibi DPBS ile janta doldurun. Elektroporatörü yapılandırmak için, poring darbesini 5 milisaniyelik bir süre, 50 milisaniye lik bir aralık ve voltaj bozunması olmadan 70 voltta bir bipolar darbeye ayarlayın. Transfer darbesini 50 milisaniyelik bir süre, 999 milisaniye lik bir aralık ve %10 voltaj bozunması ile 40 voltluk dört bipolar darbeye ayarlayın.
Daha sonra elektrotları elektroporatöre bağlayın ve elektrotları PBS kabına batırmadan önce cımbızları yedi milimetre arayla ayarlayın. Cam mikro enjeksiyon kılcal damarlar hazırlamak için, ısı değerini belirlemek için üreticinin talimatları uyarınca bir mikropipet çekmece üzerinde bir rampa testi gerçekleştirin. Daha sonra belirtilen parametrelerile konik biter enjeksiyon kılcal çekin.
Çektikten sonra, bir stereo mikroskop ve ince forseps bir açıyla kılcal kırmak için kullanın, böylece ucu yeterince ince bir konumda eğimli bir ucu var aksolotl omurganın merkezi kanal hedef için yeterince ince ise cildi delmek için yeterince güçlü kalırken. Ucu yüklemeden önce, ribonuclear protein karışımına 1-30 oranında hızlı yeşil FCF çözeltisi ekleyin ve enjeksiyon karışımının yaklaşık beş mikrolitresini kılcal damara yüklemek için jel yükleme pipet ucu kullanın. Daha sonra kılcal damarı pnömatik pompaya monte edin ve eğimli ucu aşağı bakacak şekilde.
Pnömatik pompa yapılandırmak için, inç kare başına 0,5 pound tutun ayarlayın, inç kare tutun başına iki pound fırlatma, ve kapılı süresi. Kılcal damar ve pompa ayarlarını test etmek için, kılcal damarı bir damla suya batırın ve enjekte etmek için ayak pedalına basın. Enjeksiyon karışımı yavaş ama istikrarlı bir akış içinde çıkmalıdır.
Ribonükleer protein karışımıenjekte etmek için, sedasyon onaylamak için suya baş aşağı enjekte edilecek aksolotls çevirin ve bir hayvan Silikon bir yatak üzerine bir hayvan transfer etmek için halka forceps kullanmak yukarı bakacak ve kuyruk sağa bakacak. Enjeksiyon bölgesini stereo mikroskobun görüş alanının ortasına yerleştirin ve mikromanipülörü, kılcal damarın hayvana görüş alanının sağ tarafından 60 derecelik bir açıyla gireceğini görebilmeniz için ayarlayın. Omurilik ve merkezi kanal tespit ettikten sonra, yavaşça yavaşça deri ve kas deler kadar omurilik merkezi kanal doğru kılcal hareket.
Kılcal damar pozisyondayken, karışımı merkezi kanala enjekte etmek için ayak pedalına basın ve basılı tutun. Kılcal damar düzgün yerleştirilmiş ise, ribonükleer protein karışımı her iki yönde mavi bir çizgi olarak merkezi kanal boyunca yayılır. Kılcal damarı doğru konumlandırmak zor olabilir.
Karışım doğru yayMazsa, ayak takımı basılı tutarken kılcal pozisyonu küçük adımlarla ayarlayın. Karışım omurilik ve beyindeki ventriküller sonunda terminal vezikül ulaşana kadar ayak pedalına basılı tutmaya devam edin. Enjeksiyon sırasında fırlatma basıncını ayarlamak gerekebilir.
Enjeksiyondan hemen sonra, hayvanı buz üzerinde hazırlanan agarose elektroporasyon plakasına aktarmak için halka forceps kullanın ve kuyruğu yarık içine yerleştirin, böylece agarose tarafından sandviç edilir. Tüm hayvan ve elektrotlar buz gibi PBS ile kaplı dır dikkat, kuyruk her iki tarafında kuyuiçine elektrotlar yerleştirin ve elektroporasyon başlatmak için ayak anahtarı basın. Daha sonra hayvanı tam iyileşmeye kadar izleyerek suya geri döndürün ve sonraki hayvanları da aynı şekilde enjekte edip elektroporate edin.
Nakavtın protein düzeyindeki etkinliğini değerlendirmek için kuyruğun kesitini elde edin ve standart protokollere göre immünohistokimyasal analiz yapın. Alternatif olarak, elektroporated omurilik ayıklayın ve DNA elde etmek için örnek lize. Daha sonra düzenlenen genetik loci yüzdesini değerlendirmek için Sanger sıralama veya yeni nesil sıralama ardından genotipleme PCR gerçekleştirin.
Axolotl omurilik merkezi kanalına Sox2'ye karşı Cas9 kılavuz RNA komplekslerinin enjeksiyonu ve elektroporasyonu, omurilik sinir kök hücrelerinin çoğunda Sox2 immünoraktivitesinde büyük bir kayba yol açar ve Cas9 kılavuz RNA komplekslerinin enjeksiyonve elektroporasyonunu kontrol olarak tirozinaza karşı karşılaştırır. Omurilik dokusu kesitörneklerinde Sox2-pozitif hücrelerin sayısallaştırılması, Cas9 Sox2 kılavuzu RNA elektroporasyon knock-out hayvanlarda Sox2-ekspres hücrelerin önemli ölçüde azaltılmış sayıda ortaya koymaktadır, bu yöntem omurilik sinir kök hücrelerinde etkili ve yüksek nüfuz gen knock-out yol açan gösteren. Sox2 ve GFP'ye karşı iki Cas9 kılavuz RNA kompleksinin her yerde GFP ekspresyonu olan transgenik aksokolotllara eşzamanlı enjeksiyon ve elektroporasyondan sonra, protokolün birden fazla geni esnek bir şekilde yok etmek için kullanılabileceğini gösteren yüksek oranda çift nakavt nöral kök hücre yüzdesi gözlenir.
Merkezi kanalı bir kılcal damarla hedefleme alıştırması yapmak ve enjeksiyon beklendiği gibi çalışmadığında sorun giderme adımlarını formüle koymak yararlıdır. Bu teknik, araştırmacıların rejenerasyona özgü nöral kök hücrelerdeki genlerin işlevlerini incelemelerine olanak tanır. Kılcal damarı manipüle ederken dikkatli olun ve kendi parmaklarınızı bıçaklamamaya dikkat edin.
