Dieses Protokoll ermöglicht schnelle und stark durchdringende Zeit und raumbeschränkte Gen-Knock-outs in axolotl spinalen Neuronalstammzellen für die Untersuchung der molekularen Mechanismen der Rückenmarksregeneration. Diese Technik ermöglicht die Untersuchung der Genfunktion in neuronalen Stammzellen, deren medizinische Regeneration, ohne durch Entwicklungseffekte oder Effekte anderer Zelltypen verwirrt zu werden. Axolotl neuronale Stammzellen tragen wesentlich zu ihrer Fähigkeit bei, ihre Rückenmarkse zu regenerieren.
Das Verständnis von Regenerationsmechanismen könnte zu Erkenntnissen für die Entwicklung von Behandlungen für menschliche Rückenmarksverletzungen führen. Diese Methode gibt Einen Einblick, wie axolotl neuronale Stammzellen eine regenerative Reaktion auf Rückenmarksverletzungen montieren. Die richtige Positionierung der Injektionskapillare in die Mittelsäule des Rückenmarks kann eine Herausforderung sein und das Üben an Versuchstieren hilft bei der Beherrschung der Technik.
Ein Blick auf die Verwaltung kann zeigen, wie die Injektion durchzuführen und wie eine erfolgreiche Injektion aussieht. Um die Cas9-Führung RNA ribonuclear Protein-Mischung vorzubereiten, mischen Sie fünf Mikrogramm Cas9 KernlokalisierungSequenz Protein, vier Mikrogramm Guide RNA, und 0,9 Mikroliter von 10X Cas9 Puffer. Dann bringen Sie das Gesamtvolumen auf 10 Mikroliter mit nukleasefreiem Wasser und speichern Sie die Cas9-Führung RNA ribonukleare Proteinmischung bei minus 80 Grad Celsius, wenn sie nicht sofort verwendet wird.
Für die Herstellung von Agarose-Elektroporationsplatten 200 Milliliter 2%Agarose in Dulbeccos PBS zubereiten und das Gemisch in einer Mikrowelle auflösen. Nach leichter Abkühlung die flüssige Agarose in 10-Zentimeter-Petrischalen in eine Tiefe von etwa 10 Millimetern gießen und die Platten bei Raumtemperatur erstarren lassen. Wenn die Agarose fest an der Berührung ist, verwenden Sie ein chirurgisches Skalpell, um einen Schlitz in der Agarose jeder Schale zu schneiden, um den Schwanz gerade zu halten, einen Brunnen, um den Körper des Tieres zu passen, und zwei zusätzliche Brunnen, um die Elektroden zu halten.
Dann legen Sie die Platten auf Eis und füllen Sie sie bis zum Rand mit eiskalten DPBS. Um den Elektroporator zu konfigurieren, stellen Sie den Poring-Impuls auf einen bipolaren Impuls bei 70 Volt mit einer Dauer von fünf Millisekunden, einem Intervall von 50 Millisekunden und ohne Spannungsabfall ein. Stellen Sie den Übertragungsimpuls auf vier bipolare Impulse von 40 Volt mit einer Dauer von 50 Millisekunden, einem Intervall von 999 Millisekunden und einem Spannungsabfall von 10 % ein.
Dann verbinden Sie die Elektroden mit dem Elektroporator und stellen Sie die Pinzette so ein, dass sie sieben Millimeter voneinander entfernt sind, bevor sie die Elektroden in ein Becherglas von PBS eintauchen. Um Glas-Mikroinjektionskapillaren vorzubereiten, führen Sie einen Rampentest an einem Mikropipette-Zieher gemäß den Anweisungen des Herstellers durch, um den Wärmewert zu bestimmen. Dann ziehen Sie Injektionskapillaren mit verjüngten Enden mit den angegebenen Parametern.
Nach dem Ziehen verwenden Sie ein Stereomikroskop und feine Zangen, um die Kapillare in einem Winkel zu brechen, so dass sie eine schräge Spitze an einer Position hat, wo die Spitze dünn genug ist, um den zentralen Kanal der Axolotl-Wirbelsäule anzugreifen, während sie stark genug bleibt, um die Haut zu durchbohren. Vor dem Beladen der Spitze eine schnelle grüne FCF-Lösung in das ribonukleare Proteingemisch im Verhältnis eins bis 30 geben und mit einer Gel-Ladepipettenspitze etwa fünf Mikroliter der Injektionsmischung in die Kapillare laden. Dann montieren Sie die Kapillare auf der pneumatischen Pumpe mit der geneigten Spitze nach unten.
Um die pneumatische Pumpe zu konfigurieren, stellen Sie den Haltepunkt auf 0,5 Pfund pro Quadratzoll, den Auswurf auf zwei Pfund pro Quadratzoll-Halt und die Dauer auf Gated. Um die Kapillar- und Pumpeneinstellungen zu testen, tauchen Sie die Kapillare in einen Tropfen Wasser und drücken Sie das Fußpedal, um sie zu injizieren. Die Injektionsmischung sollte in einem langsamen, aber stetigen Strom herauskommen.
Um das ribonukleare Proteingemisch zu injizieren, kippen Sie die Axolotls, die kopfüber in das Wasser injiziert werden sollen, um die Sedierung zu bestätigen, und verwenden Sie Ringzange, um ein Tier auf ein Silikonbett zu übertragen, wobei die linke Seite des Tieres nach oben zeigt und der Schwanz nach rechts zeigt. Positionieren Sie die Injektionsstelle in der Mitte des Sichtfeldes des Stereomikroskops und stellen Sie den Mikromanipulator so ein, dass die Kapillare in einem 60-Grad-Winkel von der rechten Seite des Sichtfeldes in das Tier eindringt. Nach der Identifizierung des Rückenmarks und des zentralen Kanals, bewegen Sie die Kapillare langsam in Richtung des zentralen Kanals des Rückenmarks, bis es sanft die Haut und den Muskel durchdringt.
Wenn die Kapillare in Position ist, drücken und halten Sie das Fußpedal gedrückt, um die Mischung in den zentralen Kanal zu injizieren. Wenn die Kapillare richtig platziert wurde, breitet sich das ribonukleare Proteingemisch entlang des zentralen Kanals als blaue Linie in beide Richtungen aus. Es kann schwierig sein, die Kapillare richtig zu positionieren.
Wenn sich die Mischung nicht richtig ausbreitet, stellen Sie die Kapillarposition in kleinen Schritten ein, während Sie das Fußpolster gedrückt halten. Halten Sie das Fußpedal so lange gedrückt, bis die Mischung das Terminalvesikel am Ende des Rückenmarks und die Ventrikel im Gehirn erreicht. Es kann notwendig sein, den Auswurfdruck während der Injektion einzustellen.
Unmittelbar nach der Injektion verwenden Sie Ringzange, um das Tier auf die vorbereitete Agarose-Elektroporationsplatte auf Eis zu übertragen und den Schwanz in den Schlitz zu legen, so dass er von der Agarose eingeklemmt wird. Legen Sie die Elektroden in die Brunnen auf beiden Seiten des Schwanzes, wobei darauf zu achten ist, dass das gesamte Tier und die Elektroden mit eiskaltem PBS bedeckt sind, und drücken Sie den Fußschalter, um die Elektroporation zu starten. Dann geben Sie das Tier mit Überwachung bis zur vollständigen Genesung ins Wasser zurück und injizieren und elektroporate die nachfolgenden Tiere auf die gleiche Weise.
Um die Effizienz des Knock-out auf Proteinebene zu bewerten, erhalten Sie einen Querschnitt des Schwanzes und führen Sie immunhistochemische Analysen nach Standardprotokollen durch. Alternativ extrahieren Sie das elektroporated Rückenmark und lyse die Probe, um die DNA zu erhalten. Führen Sie dann genotypiierende PCR durch, gefolgt von Sanger-Sequenzierung oder Sequenzierung der nächsten Generation, um den Prozentsatz der bearbeiteten genetischen Loci zu bewerten.
Die Injektion und Elektroporation von Cas9-Führungs-RNA-Komplexen gegen Sox2 in den Axolotl-Rückenmarks-Zentralkanal führt zu einem massiven Verlust der Sox2-Immunreaktivität in der Mehrheit der neuralen Stammzellen des Rückenmarks, die die Injektion und Elektroporation von Cas9-Führungs-RNA-Komplexen gegen Tyrosinase als Kontrolle verglichen. Die Quantifizierung von Sox2-positiven Zellen in Gewebeproben des Rückenmarksgewebes zeigt eine signifikant reduzierte Anzahl von Sox2-exezierenden Zellen in Cas9 Sox2-Führungs-RNA-Elektroporation-Knock-out-Tieren, was darauf hindeutet, dass diese Methode zu einem effizienten und stark durchdringenden Gen-Knock-out in neuronalen Stammzellen des Rückenmarks führt. Nach gleichzeitiger Injektion und Elektroporation von zwei Cas9-Führungs-RNA-Komplexen gegen Sox2 und GFP in transgene Axolotle mit allgegenwärtiger GFP-Expression wird ein hoher Anteil an neuronalen Doppel-Knock-out-Stammzellen beobachtet, was darauf hindeutet, dass das Protokoll verwendet werden kann, um mehrere Gene flexibel auszuschalten.
Es ist hilfreich, zu üben, den zentralen Kanal mit einer Kapillare zu zielen und Formel mit den Fehlerbehebungsschritten für wenn die Injektion nicht wie erwartet funktioniert. Diese Technik ermöglicht es Forschern, die Funktionen von Genen in neuronalen Stammzellen zu untersuchen, die spezifisch für die Regeneration sind. Achten Sie bei der Manipulation der Kapillare darauf, dass Sie nicht auf Ihre eigenen Finger stechen.
