Este protocolo permite eliminaciones genéticas rápidas y de alta penetración en células madre neuronales de la médula espinal axolotl para el estudio de los mecanismos moleculares de la regeneración de la médula espinal. Esta técnica permite el estudio de la función génica en las células madre neurales, su regeneración médica sin ser confundido por efectos del desarrollo o efectos de otros tipos de células. Las células madre neurales de Axolotl contribuyen en gran medida a su capacidad para regenerar sus médulas espinales.
Comprender los mecanismos de regeneración podría conducir a información para el desarrollo de tratamientos para lesiones de la médula espinal humana. Este método proporciona información sobre cómo las células madre neurales del axolotl montan una respuesta regenerativa a la lesión de la médula espinal. Colocar correctamente el capilar de inyección en la columna central de la médula espinal puede ser un reto y practicar en animales de prueba ayuda con el dominio de la técnica.
Ver la administración puede mostrar cómo realizar la inyección y cómo se ve una inyección exitosa. Para preparar la mezcla de proteína ribonuclear de ARN guía Cas9, mezcle cinco microgramos de proteína de secuencia de localización nuclear Cas9, cuatro microgramos de ARN guía y 0,9 microlitros de tampón 10X Cas9. A continuación, lleve el volumen total a 10 microlitros con agua libre de nucleasas y almacene la mezcla de proteína ribonuclear de ARN guía Cas9 a menos 80 grados centígrados si no se utiliza inmediatamente.
Para la preparación de la placa de electroporación de agarosa, preparar 200 mililitros de 2% de agarosa en PBS de Dulbecco y disolver la mezcla en un microondas. Después de un ligero enfriamiento, verter la agarosa líquida en platos Petri de 10 centímetros a una profundidad de unos 10 milímetros y permitir que las placas se solidificen a temperatura ambiente. Cuando la agarosa es firme al tacto, utilice un bisturí quirúrgico para cortar una hendidura en la agarosa de cada plato para sostener la cola recta, un pozo para adaptarse al cuerpo del animal, y dos pozos adicionales para sostener los electrodos.
A continuación, coloque las placas sobre hielo y llénalas hasta el borde con DPBS heladas. Para configurar el electroporador, ajuste el pulso de porción a un pulso bipolar a 70 voltios con una duración de cinco milisegundos, un intervalo de 50 milisegundos y sin decaimiento de voltaje. Establezca el pulso de transferencia en cuatro pulsos bipolares de 40 voltios con una duración de 50 milisegundos, un intervalo de 999 milisegundos y una decaimiento de 10% de voltaje.
A continuación, conecte los electrodos al electroporador y ajuste las pinzas para que estén separadas a siete milímetros antes de sumergir los electrodos en un vaso de precipitados de PBS. Para preparar los capilares de microinyección de vidrio, realice una prueba de rampa en un tirador de micropipeta según las instrucciones del fabricante para determinar el valor de calor. A continuación, tire de los capilares de inyección con extremos cónicos con los parámetros indicados.
Después de tirar, utilice un microscopio estéreo y fórceps finos para romper el capilar en un ángulo de modo que tenga una punta inclinada en una posición donde la punta es lo suficientemente delgada como para apuntar al canal central de la columna vertebral de axolotl mientras permanece lo suficientemente fuerte como para perforar la piel. Antes de cargar la punta, agregue una solución FCF verde rápida a la mezcla de proteína ribonuclear en una proporción de uno a 30 y utilice una punta de pipeta de carga en gel para cargar unos cinco microlitros de la mezcla de inyección en el capilar. A continuación, monte el capilar en la bomba neumática con la punta inclinada hacia abajo.
Para configurar la bomba neumática, ajuste la retención a 0,5 libras por pulgada cuadrada, la expulsión a dos libras por pulgada cuadrada de retención, y la duración a cerrada. Para probar los ajustes capilares y de la bomba, sumerja el capilar en una gota de agua y presione el pedal para inyectar. La mezcla de inyección debe salir en un flujo lento pero constante.
Para inyectar la mezcla de proteína ribonuclear, voltee los axolotls que se van a inyectar boca abajo en el agua para confirmar la sedación y utilice fórceps de anillo para transferir un animal a un lecho de silicona con el lado izquierdo del animal mirando hacia arriba y la cola apuntando hacia la derecha. Coloque el lugar de inyección en el centro del campo de visión del microscopio estéreo y ajuste el micromaniprógrafo para que el capilar entre en el animal en un ángulo de 60 grados desde el lado derecho del campo de visión. Después de identificar la médula espinal y el canal central, mueva lentamente el capilar hacia el canal central de la médula espinal hasta que perfore suavemente la piel y el músculo.
Cuando el capilar esté en posición, mantenga presionado el pedal para inyectar la mezcla en el canal central. Si el capilar se ha colocado correctamente, la mezcla de proteína ribonuclear se extenderá a lo largo del canal central como una línea azul en ambas direcciones. Puede ser difícil posicionar el capilar correctamente.
Si la mezcla no se extiende correctamente, ajuste la posición capilar en pequeños pasos mientras mantiene presionada la almohadilla. Continúe presionando el pedal hasta que la mezcla llegue a la vesícula terminal al final de la médula espinal y los ventrículos en el cerebro. Es posible que sea necesario ajustar la presión de eyección durante la inyección.
Inmediatamente después de la inyección, utilice fórceps de anillo para transferir al animal a la placa de electroporación de agarosa preparada sobre hielo y coloque la cola dentro de la hendidura de modo que sea empareda por la agarosa. Coloque los electrodos en los pozos a ambos lados de la cola, teniendo cuidado de que todo el animal y los electrodos estén cubiertos por PBS helado y presione el interruptor del pie para iniciar la electroporación. A continuación, devolver el animal al agua con monitoreo hasta la recuperación completa e inyectar y electroporar a los animales subsiguientes de la misma manera.
Para evaluar la eficiencia del knock-out a nivel proteico, obtenga una sección transversal de la cola y realice análisis inmunohistoquímicos de acuerdo con los protocolos estándar. Alternativamente, extraiga la médula espinal electroporada y anlice la muestra para obtener el ADN. A continuación, realice la PCR de genotipado seguida de la secuenciación de Sanger o la secuenciación de próxima generación para evaluar el porcentaje de loci genéticos editados.
La inyección y electroporación de los complejos de ARN guía Cas9 contra Sox2 en el canal central de la médula espinal aolotl conduce a una pérdida masiva de inmunoreactividad Sox2 en la mayoría de las células madre neurales de la médula espinal en comparación con la inyección y electroporación de los complejos de ARN guía Cas9 contra la tirosinasa como control. La cuantificación de las células positivas de Sox2 en las muestras de sección del tejido de la médula espinal revela un número significativamente reducido de células que expresan los Sox2 en los animales de electroporación de ARN guía Cas9 Sox2, lo que indica que este método conduce a un noqueo genético eficiente y altamente penetrante en las células madre neurales de la médula espinal. Después de la inyección simultánea y la electroporación de dos complejos de ARN guía Cas9 contra Sox2 y GFP en axolotls transgénicos con expresión omnipresente de GFP, se observa un alto porcentaje de células madre neurales de doble nocaut, lo que indica que el protocolo se puede utilizar para eliminar de forma flexible múltiples genes.
Es útil practicar la orientación del canal central con un capilar y ponerse la fórmula con los pasos de solución de problemas para cuando la inyección no funciona como se esperaba. Esta técnica permite a los investigadores estudiar las funciones de los genes en las células madre neurales que son específicas de la regeneración. Tenga cuidado al manipular el capilar y asegúrese de no apuñalar sus propios dedos.
