Este protocolo permite o tempo rápido e altamente penetrante e eliminações genéticas com restrição de espaço em células-tronco neurais da medula espinhal axolotl para estudo dos mecanismos moleculares de regeneração da medula espinhal. Esta técnica permite o estudo da função genética em células-tronco neurais, sua regeneração médica sem ser confundida por efeitos de desenvolvimento ou efeitos de outros tipos celulares. Células-tronco neurais axolotil contribuem em grande parte para sua capacidade de regenerar suas medulas espinhais.
Compreender mecanismos de regeneração pode levar a insights para o desenvolvimento de tratamentos para lesão medular humana. Este método fornece uma visão de como as células-tronco neurais axolotl montam uma resposta regenerativa à lesão medular. Posicionar corretamente a injeção capilar na coluna central da medula espinhal pode ser desafiador e praticar em animais de teste ajuda na dominar a técnica.
Ver a administração pode mostrar como executar a injeção e como é uma injeção bem sucedida. Para preparar a mistura de proteína ribonuclear RNA guia Cas9, misture cinco microgramas de proteína sequência de localização nuclear Cas9, quatro microgramas de RNA guia e 0,9 microliters de tampão 10X Cas9. Em seguida, leve o volume total para 10 microlitadores com água sem nuclease e armazene a mistura de proteína ribonuclear RNA guia Cas9 a menos 80 graus Celsius se não for usada imediatamente.
Para a preparação da placa de eletroporação agarose, prepare 200 mililitros de 2% de agarose no PBS de Dulbecco e dissolva a mistura em um micro-ondas. Após um leve resfriamento, despeje o líquido em placas de Petri de 10 centímetros a uma profundidade de cerca de 10 milímetros e permita que as placas se solidifiquem à temperatura ambiente. Quando a agarose estiver firme ao toque, use um bisturi cirúrgico para cortar uma fenda na agarose de cada prato para segurar a cauda reta, um poço para caber no corpo do animal, e dois poços extras para segurar os eletrodos.
Em seguida, coloque as placas no gelo e encha-as na borda com DPBS gelados. Para configurar o eletroporador, coloque o pulso de desarmamento em um pulso bipolar a 70 volts com uma duração de cinco milissegundos, um intervalo de 50 milissegundos e nenhuma decadência de tensão. Defina o pulso de transferência para quatro pulsos bipolares de 40 volts com uma duração de 50 milissegundos, um intervalo de 999 milissegundos e uma decadência de 10%.
Em seguida, conecte os eletrodos ao eletroporador e ajuste as pinças de modo que elas estejam a sete milímetros de distância antes de submergir os eletrodos em um béquer de PBS. Para preparar capilares de micro-injeção de vidro, realize um teste de rampa em um puxador de micropipette de acordo com as instruções do fabricante para determinar o valor do calor. Em seguida, puxe capilares de injeção com extremidades afiladas com os parâmetros indicados.
Depois de puxar, use um microscópio estéreo e fórceps finos para quebrar o capilar em um ângulo de modo que ele tenha uma ponta inclinada em uma posição onde a ponta é fina o suficiente para atingir o canal central da coluna axolotl enquanto permanece forte o suficiente para perfurar a pele. Antes de carregar a ponta, adicione a solução FCF verde rápida à mistura de proteína ribonuclear em uma proporção de um a 30 e use uma ponta de pipeta de carregamento de gel para carregar cerca de cinco microliters da mistura de injeção no capilar. Em seguida, monte o capilar na bomba pneumática com a ponta inclinada voltada para baixo.
Para configurar a bomba pneumática, ajuste o porão para 0,5 libras por polegada quadrada, a ejeção para dois quilos por polegada quadrada e a duração do portão. Para testar as configurações capilares e da bomba, mergulhe o capilar em uma gota de água e pressione o pedal do pé para injetar. A mistura de injeção deve sair em um fluxo lento, mas constante.
Para injetar a mistura de proteína ribonuclear, vire os axlotls a serem injetados de cabeça para baixo na água para confirmar a sedação e use fórceps de anel para transferir um animal para um leito de silicone com o lado esquerdo do animal voltado para cima e a cauda apontando para a direita. Posicione o local da injeção no meio do campo de visão do microscópio estéreo e ajuste o micromanipulador para que o capilar entre no animal em um ângulo de 60 graus do lado direito do campo de visão. Depois de identificar a medula espinhal e o canal central, mova lentamente o capilar em direção ao canal central da medula espinhal até perfurar suavemente a pele e o músculo.
Quando o capilar estiver em posição, pressione e segure o pedal do pé para injetar a mistura no canal central. Se o capilar tiver sido devidamente colocado, a mistura de proteína ribonuclear se espalhará ao longo do canal central como uma linha azul em ambas as direções. Pode ser desafiador posicionar o capilar corretamente.
Se a mistura não se espalhar corretamente, ajuste a posição capilar em pequenos passos, mantendo o footpad pressionado. Continue a segurar o pedal do pé até que a mistura atinja o vesículo terminal no final da medula espinhal e os ventrículos no cérebro. Pode ser necessário ajustar a pressão de ejeção durante a injeção.
Imediatamente após a injeção, use fórceps de anel para transferir o animal para a placa de eletroporação preparada no gelo e coloque a cauda dentro da fenda para que seja sanduíche pela agarose. Coloque os eletrodos nos poços de ambos os lados da cauda, tomando cuidado para que todo o animal e eletrodos estejam cobertos por PBS gelado e pressione o interruptor do pé para iniciar a eletroporação. Em seguida, devolva o animal à água com monitoramento até a recuperação completa e injete e eletroporate os animais subsequentes da mesma forma.
Para avaliar a eficiência do knock-out no nível da proteína, obtenha uma seção transversal da cauda e realize análises imunohistoquímicas de acordo com os protocolos padrão. Alternativamente, extrair a medula espinhal eletroporada e lise a amostra para obter o DNA. Em seguida, execute o PCR genotipagem seguido de sequenciamento Sanger ou sequenciamento de próxima geração para avaliar a porcentagem de loci genético editado.
A injeção e eletroporação dos complexos de RNA guiado Cas9 contra Sox2 no canal central da medula espinhal axolotl leva a uma perda maciça de imunoreatividade Sox2 na maioria das células-tronco neurais da medula espinhal comparou a injeção e eletroporação dos complexos de RNA guia Cas9 contra a tyrosinase como controle. A quantificação de células positivas sox2 em amostras de seção de tecido medular revela um número significativamente reduzido de células expressas sox2 em animais de eletroporação de RNA guiado Cas9 Sox2, indicando que este método leva a um eficiente e altamente penetrante nocaute genético em células-tronco neurais da medula espinhal. Após injeção simultânea e eletroporação de dois complexos de RNA guiado Cas9 contra Sox2 e GFP em axolotls transgênicos com expressão GFP onipresente, observa-se uma alta porcentagem de células-tronco neurais duplas, indicando que o protocolo pode ser usado para derrubar de forma flexível múltiplos genes.
É útil praticar o direcionamento do canal central com um capilar e colocar fórmula com os passos de solução de problemas para quando a injeção não funcionar como esperado. Essa técnica permite que os pesquisadores estudem as funções de genes em células-tronco neurais específicas para a regeneração. Tome cuidado ao manipular o capilar e certifique-se de não esfaquear seus próprios dedos.
