Этот протокол позволяет быстро и высоко проникающее время и пространство ограниченных генных нокаутов в аксолотл спинного мозга нервных стволовых клеток для изучения молекулярных механизмов регенерации спинного мозга. Этот метод позволяет изучать функцию генов в нервных стволовых клетках, его медицинскую регенерацию, не путаясь с последствиями развития или эффектами других типов клеток. Аксолотл нервных стволовых клеток в значительной степени способствовать их способности регенерировать спинной мозг.
Понимание механизмов регенерации может привести к пониманию для разработки методов лечения травм спинного мозга человека. Этот метод дает представление о том, как аксолотл нервных стволовых клеток монтировать регенеративную реакцию на повреждение спинного мозга. Правильное позиционирование инъекций капилляров в центральный столб спинного мозга может быть сложной задачей и практикующих на тест животных помогает с освоением техники.
Просмотр администрации может показать, как выполнить инъекцию и как выглядит успешная инъекция. Для подготовки смеси РНК-рибонуклеарной белковой смеси Cas9 смешайте пять микрограммов белка последовательности ядерной локализации Cas9, четыре микрограмма направляющий РНК и 0,9 микролитров буфера 10X Cas9. Затем доведите общий объем до 10 микролитров с безклеазной водой и храните смесь РНК-рибонуклеарного белка Cas9 при температуре минус 80 градусов по Цельсию, если не использовать ее немедленно.
Для подготовки электропорации агарозной пластины приготовьте 200 миллилитров 2%агарозы в PBS Дулбекко и растворите смесь в микроволновой печи. После небольшого охлаждения, залить жидкой агарозой в 10-сантиметровые чашки Петри на глубину около 10 миллиметров и позволить пластин затвердеть при комнатной температуре. Когда агароза тверда на ощупь, используйте хирургический скальпель, чтобы вырезать щель в агарозе каждого блюда для проведения хвост прямо, хорошо, чтобы соответствовать телу животного, и два дополнительных колодца для проведения электродов.
Затем поместите тарелки на лед и заполните их обода ледяным DPBS. Чтобы настроить электропоратор, установите пульс углубивания в один биполярный импульс на 70 вольт с продолжительностью пять миллисекунд, интервалом в 50 миллисекунд и отсутствием распада напряжения. Установите импульс передачи до четырех биполярных импульсов 40 вольт с продолжительностью 50 миллисекунд, интервалом 999 миллисекунд и 10%-ным распадом напряжения.
Затем подключите электроды к электропоратору и отрегулируйте пинцет так, чтобы они были на семь миллиметров друг от друга, прежде чем погрузить электроды в стакан PBS. Для подготовки стеклянных микро-инъекций капилляров, выполнить тест рампы на шкив микропайпта в соответствии с инструкциями производителя, чтобы определить теплосмощь. Затем потяните инъекционные капилляры с конические концы с указанными параметрами.
После потянув, использовать стерео микроскоп и тонкие типсы, чтобы сломать капилляр под углом так, что он имеет наклонный кончик в положении, когда кончик достаточно тонкий, чтобы целевой центральный канал аксолотля позвоночника, оставаясь достаточно сильным, чтобы проколоть кожу. Перед загрузкой наконечника добавьте быстрое зеленое решение FCF в рибонуклеарную белковую смесь в соотношении от одного до 30 и используйте наконечник трубочки для загрузки около пяти микролитров смеси инъекций в капилляр. Затем смонтировать капилляр на пневматический насос с наклонным кончиком лицом вниз.
Чтобы настроить пневматический насос, установите удержание до 0,5 фунтов на квадратный дюйм, выброс до двух фунтов на квадратный дюйм провести, и продолжительность закрытой. Чтобы проверить настройки капилляров и насосов, окуните капилляр в капилляр в каплю воды и нажмите педаль ноги, чтобы ввести. Смесь инъекций должна выходить в медленном, но устойчивом потоке.
Чтобы ввести рибонуклеарную белковую смесь, переверните аксолотлы, которые будут введены вверх дном в воду, чтобы подтвердить осея и использовать forceые кольца для передачи одного животного на кровать из силикона с левой стороны животного вверх и хвост, указывающий на право. Распоистить место инъекции в середине поля зрения стерео микроскопа и настроить микроманипулятор так, чтобы капилляр вошел в животное под углом 60 градусов с правой стороны поля зрения. После выявления спинного мозга и центрального канала, медленно двигаться капилляров к центральному каналу спинного мозга, пока он мягко пронзает кожу и мышцы.
Когда капилляр находится в положении, нажмите и удерживайте педаль ноги, чтобы ввести смесь в центральный канал. Если капилляр был правильно помещен, рибонуклеарная белковая смесь будет распространяться вдоль центрального канала в качестве синей линии в обоих направлениях. Это может быть сложной задачей, чтобы распоставить капилляр правильно.
Если смесь не распространяется правильно, отрегулируйте положение капилляров небольшими шагами, сохраняя при этом нажатую подножку. Продолжайте удерживать педаль стопы, пока смесь не достигнет терминала пузырьков в конце спинного мозга и желудочков в головном мозге. Возможно, необходимо настроить давление выброса во время инъекции.
Сразу же после инъекции используйте кольцевые типсы для переноса животного на подготовленную агарозную электропорацию пластины на льду и поместите хвост внутри щели так, чтобы он был зажат агарозой. Поместите электроды в колодцы по обе стороны хвоста, заботясь о том, чтобы все животное и электроды были покрыты ледяным PBS и нажмите переключатель ноги, чтобы начать электропорацию. Затем вернуть животное в воду с мониторингом до полного восстановления и введения и электропората последующих животных таким же образом.
Для оценки эффективности нокаута на уровне белка, получить поперечное сечение хвоста и выполнить иммуногистохимический анализ в соответствии со стандартными протоколами. Кроме того, извлечь электропотерированный спинной мозг и подлизать образец для получения ДНК. Затем выполните генотипирование ПЦР с последующим секвенированием Сэнгера или секвенированием следующего поколения для оценки процента отредактированных генетических локусов.
Инъекции и электропорации Cas9 руководство РНК комплексов против Sox2 в аксолотль спинного мозга центрального канала приводит к массовой потере Sox2 иммунореактивности в большинстве нервных стволовых клеток спинного мозга по сравнению с инъекцией и электропорации Cas9 руководство РНК комплексов против тирозиназы в качестве контроля. Количественная оценка Sox2-положительных клеток в образцах секции ткани спинного мозга показывает значительно уменьшенное количество Sox2-экспрессивных клеток в Cas9 Sox2 руководство РНК электропорации нокаутом животных, указывая, что этот метод приводит к эффективной и высоко проникающей гена нокаут в спинном мозге нервных стволовых клеток. После одновременной инъекции и электропорации двух комплексов CAS9 руководство РНК против Sox2 и GFP в трансгенных аксолотлов с вездесущим выражением GFP, высокий процент двойного нокаута нервных стволовых клеток наблюдается, что свидетельствует о том, что протокол может быть использован для гибко выбить несколько генов.
Полезно практиковать таргетинг на центральный канал с капилляром и надеть формулу с шагами по устранению неполадок, когда инъекция не работает, как ожидалось. Этот метод позволяет исследователям изучать функции генов в нервных стволовых клетках, которые специфичны для регенерации. Позаботьтесь при манипулировании капилляров и убедитесь, что не ударяет пальцами.
