האם אי פעם חשבת על רתימת הכוח של מיקרודיסקציה לכידת לייזר לניתוח של ביטוי גנים בתאי עצם ספציפיים בתוך הסביבה הטבעית שלהם? כאן, אנו מתארים פרוטוקול שיאפשר לך להשיג כמויות מספיקות של RNA באיכות גבוהה מ cryosections של עצמות העכבר. טכנולוגיה זו היא כלי נהדר לבחינת שינויים בביטוי גנים בתאי עצם ספציפיים במודלים של עכברים מהונדסים גנטית או במודלים של מחלות.
הפרוטוקול המתואר כאן מתמקד בעצמות עכבר, אך ניתן להשתמש בו כדי לחקור באתרו ביטוי גנים בתאים של כל רקמה קשה בכל מין. אם נעזור להדגים את ההליך הזה, תהיה כריסטיאן שולר, טכנאית מהמעבדה שלי. לאחר המתת חום עכברים על ידי exsanguination תחת הרדמה כללית, להסיר עצם הירך שלם במהירות.
השתמש אזמל ומגבות נייר כדי לנקות את עצם הירך של הרקמות הרכות שמסביב. לאחר מכן, יוצקים תרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית לתוך התבנית המטביעה וממקמים את עצם הירך בתחתית תבניות ההטבעה. הצמד להקפיא את הדגימות בחנקן נוזלי.
לאחר הדגימות קפואות לחלוטין, לעטוף אותם בנייר כסף ולהעביר אותם על קרח יבש למקפיא. לאחסן אותם במינוס 80 מעלות צלזיוס עד מוכן לעיבוד נוסף. ראשית, הגדר את הטמפרטורה בהקפאט למינוס 19 מעלות צלזיוס ואת הטמפרטורה של מחזיק הבלוק למינוס 17 מעלות צלזיוס.
לאחר מכן, לנגב את הפנים של קריוסטט עם 70% אתנול. מניחים את הלהב החד פעמי עבור רקמות קשות, שקופיות זכוכית, כלי הולם לתוך cryostat להתקרר, ולשמור אותם בתוך cryostat למשך החיתוך. מעבירים את בלוק הרקמה הקפואה על קרח יבש להקפאה ומאפשרים לו לצייד לפחות 10 דקות.
לאחר מכן, לחץ על החלק התחתון של התבנית הטבעה לדחוף את בלוק OCT מתוך התבנית. החל מספיק מדיום OCT על מחזיק הבלוק כדי לדבוק בלוק אליו ולחכות עד המדיום OCT קופא לחלוטין. לאחר מכן, מקם את מחזיק הבלוק במחזיק האובייקט והדק אותו במקומו.
כוונן את מיקום הלהב וחתוך את הבלוק במרווחי חיתוך של 15 מיקרומטר כדי להסיר את ה- OCT המכסה את הדגימה. התאימו את ההקפאה כדי ליצור מקטעים של שמונה מיקרומטר וחותכים שניים עד שלושה קריוסטאטים שיזרקו. מניחים סרט דבק על הבלוק ולהשתמש בכלי ההתאמה כדי לדבוק בסרט לבלוק.
עכשיו, לעשות חתך לאט ובהירות מתמדת, תוך החזקת הקטע על ידי הסרט. מניחים את הסרט עם המדגם פונה כלפי מעלה על מגלשת זכוכית מקוררת מראש על ההקפאה בתוך cryostat, כדי למנוע הפשרה של המדגם. השתמש בקלטת כדי לתקן את הסרט לשקופית הזכוכית עבור ויטראז'ים קלים יותר.
במכסה המנוע של האדים, הכינו את הפתרונות הדרושים לאתנול, מים נטולי RNase וקצילן על קרח כמתואר בפרוטוקול הטקסט. דגירה את החלקים ב95% אתנול במשך 30 שניות. לאחר מכן, בזהירות לטבול את החלקים במים ללא RNase במשך 30 שניות כדי להסיר לחלוטין את OCT.
לאחר מכן, מחלקים 50 מיקרוליטרים של כתם קטע קפוא LCM מסחרי על החלק ודורגים בטמפרטורת החדר למשך 10 שניות. רוקן את המקטע על-ידי הנחת קצה השקופית על נייר טישו סופג. לשטוף את החלק ב 100%אתנול במשך 30 שניות כדי להסיר כל כתם עודף.
לטבול את חלקי העצם בצינור השני המכיל 100% אתנול במשך 30 שניות ולאחר מכן, להעביר אותם 100% קסילן במשך 30 שניות. שים סרט דבק על מגלשת זכוכית יבשה כתמיכה, דואג למקם את הסרט שטוח ככל האפשר. לאחר מכן, מקם שקופית מסגרת קרום PET על הסרט ולחץ בקצרה על אצבע כפפה על הממברנה כדי לחבר אותו לסרט.
מדגם זה יהיה דחוק בין הממברנה לסרט דבק. הסרט דבק לא צריך להיות מקופל או מקומט ולא צריך להיות בועות אוויר בין הסרט לבין הממברנה. התחל באמצעות מזהה משטח כדי לנקות את מחזיק מכסה קצה הבמה.
טען את השקופית למחזיק השקופית ואת הכובעים למחזיק הכובע. לאחר מכן, התאם את המוקד ורכוש סקירת שקופית עם המטרה 1.25x. שנה למטרה 40x והתאם את המוקד.
באמצעות סקירת השקופית, בחר את אזור העניין. לאחר מכן, להתאים את הפרמטרים לייזר כפי שמוצג כאן, הקפד לייעל פרמטרים אלה עבור כל מטרה. אם הלייזר לא מצליח לחתוך את הדגימה, להגדיל את כוח הלייזר.
בחר אוסטאובלסט, אוסטאוסיטים ותאי בטנת עצם בעצם הירך הדיסטלית או בקליפת המוח בהתבסס על קריטריונים מורפולוגיים. צייר קו לנתיב הלייזר רחוק יותר מתאים היעד כדי למזער את הנזק על ידי לייזר UV. אם הלייזר אינו מצליח לחתוך את המדגם, להחיל את הלייזר יותר מפעם אחת או לבדוק את היעד עבור כתמים של חתכים שלמים ולהשתמש בתנועה לחתוך אפשרות לחתוך את הרקמה כתמים אלה.
לאסוף כל סוג תא בכובע צינור נפרד 0.5 מיליליטר. ראשית, מחלקים 50 מיקרוליטרים של מאגר התיזה המכיל בטא mercaptoethanol לתוך הכובע של צינור האיסוף. Lyse המדגם על ידי pippetting אותו למעלה ולמטה בכובע במשך דקה אחת.
לאחר מכן, לסובב את lysate ולהוסיף 00 microliters של מאגר תיזה המכיל בטא-mercaptoethanol לצינור. עבור כל שקופית, להכין צינור microcentrifuge שכותרתו עם 350 microliters של מאגר תמוגה המכילה-בטא mercaptoethanol. השתמש במקטעים שנותרו לאחר LCM כדי לחלץ RNA.
בזהירות להפריד את הסרט מן הממברנה lyse המדגם על ידי לאט pippetting מאגר תיזה על החלק מספר פעמים. לאחר מכן, לשים את דגימות ליזית על קרח יבש ולאחסן אותם במינוס 80 מעלות צלזיוס. כאשר מוכן להמשיך, להפשיר את lysates בטמפרטורת החדר.
לאחר מכן, להעביר את lysates מתאים שנקטפו LCM בצינורות האוסף חדש 1.5 מיליליטר צינורות microcentrifuge ולחלץ RNA על פי הוראות היצרן. במחקר זה, פרוטוקול LCM מפותח כדי להשיג כמות מספקת של RNA באיכות גבוהה לניתוח ביטוי גנים בתאי העצם של עצם הירך. LCM מבוצעת באמצעות מערכת LCM המשתמשת בכבידה לאיסוף מדגם.
התשואה והשלימות של רנ"א מבודד נמדדו באמצעות אלקטרופורזה מיקרו-קפילרית. ההבדל באיכות RNA ובכמות שהושגו באמצעות פרוטוקולי תזה שונים ניתן לראות כאן בג'ל מייצג אלקטרופרוגרמות. כאשר המדגם הוא lysed על ידי pippetting למעלה ולמטה בכובע במשך דקה אחת, ניתן לבודד כ 8.5 ננוגרם של RNA ממילימטר מרובע אחד של רקמת עצם microdissected.
ערך RIN הוא 8.60. לחלופין, LCM מבוצעת באמצעות מערכת LCM המשתמשת בדופק לייזר מנומר, אשר מקפיץ את החומר לתוך מכסה דבק overhanging. עבור עצמות קפואות טריות, ניתן לבודד כ 1.6 ננוגרם של RNA ממילימטר מרובע אחד של רקמת עצם microdissected.
הערך RIN הוא אחד. לסיכום, הדברים החשובים ביותר שיש לזכור בהליך זה הם ליישם את פרוטוקול העמידה בצורה הנכונה, למנוע ייבוש מלא של חלקים במתחם הכריך, להשתמש במערכת LCM מתאימה, ולא לחרוג ממגבלות הזמן לקצירת התאים. לאחר שבודדת את ה- RNA מהתאים שנלכדו, באפשרותך להשתמש ב- RNA עבור יצירת פרופילי ביטויים, לדוגמה, על-ידי RNA seek.
לבסוף, ברצוננו להזכיר לך כי קסילן ובטא-mercaptoethanol הם חומרים מסוכנים כי צריך להיות מטופלים מתחת למכסה המנוע. בנוסף, יש לנקוט באמצעי זהירות מתאימים בעת טיפול בחנקן נוזלי וגם בלהבי הקריוטום.
