Avez-vous déjà pensé à exploiter la puissance de la microdissection de capture laser pour l’analyse de l’expression des gènes dans des cellules osseuses spécifiques dans leur environnement naturel? Ici, nous décrivons un protocole qui vous permettra d’obtenir des quantités suffisantes d’ARN de haute qualité à partir de cryosections d’os de souris. Cette technologie est un excellent outil pour examiner les changements dans l’expression des gènes dans des cellules osseuses spécifiques dans des modèles de souris génétiquement modifiés ou dans des modèles de maladies.
Le protocole décrit ici est axé sur les os de souris, mais peut être utilisé pour étudier in situ une expression génétique dans les cellules de n’importe quel tissu dur chez n’importe quelle espèce. Christiane Schueler, technicienne de mon laboratoire, aidera à démontrer cette procédure. Après avoir euthanasié des souris par exsanguination sous anesthésie générale, enlevez rapidement les fémurs entiers.
Utilisez un scalpel et des serviettes en papier pour nettoyer les fémurs des tissus mous environnants. Ensuite, versez le composé optimal de température de coupe dans le moule d’intégration et placez les fémurs dans le fond des moules d’intégration. Casser congeler les échantillons dans de l’azote liquide.
Une fois que les échantillons sont entièrement congelés, enveloppez-les dans du papier d’aluminium et transférez-les sur de la glace sèche au congélateur. Conservez-les à moins 80 degrés Celsius jusqu’à ce qu’ils soient prêts pour un traitement ultérieur. Tout d’abord, réglez la température dans le cryostat à moins 19 degrés Celsius et la température du support du bloc à moins 17 degrés Celsius.
Ensuite, essuyez l’intérieur du cryostat avec 70% d’éthanol. Placez la lame jetable pour les tissus durs, les glissières en verre, et un outil d’ajustement dans le cryostat pour refroidir, et gardez-les à l’intérieur du cryostat pour la durée de la section. Transférer le bloc de tissu congelé sur la glace sèche au cryostat et lui permettre d’équilibrer pendant au moins 10 minutes.
Ensuite, appuyez sur le fond du moule d’intégration pour pousser le bloc OCT hors du moule. Appliquez suffisamment d’OCT moyen sur le support du bloc pour y adhérer et attendre que le milieu oct gèle complètement. Après cela, placez le support de bloc dans le support de l’objet et serrez-le en place.
Ajustez la position de la lame et coupez le bloc en incréments de coupe de 15 micromètres pour enlever l’OCT couvrant l’échantillon. Ajustez le cryostat pour générer des sections de huit micromètres et coupez deux à trois cryosections qui seront jetées. Placez le film adhésif sur le bloc et utilisez l’outil de montage pour adhérer au film au bloc.
Maintenant, faire une coupe lentement et à vitesse constante, tout en tenant la section par le film. Placez le film avec l’échantillon face vers le haut sur une lame de verre pré-refroidie sur le cryobar dans le cryostat pour éviter le dégel de l’échantillon. Utilisez du ruban adhésif pour fixer le film à la glissière en verre pour faciliter la coloration.
Dans une hotte de fumée, préparez les solutions nécessaires de l’éthanol, de l’eau sans RNase et du xylène sur glace, comme le décrit le protocole textuel. Incuber les sections à 95 % d’éthanol pendant 30 secondes. Ensuite, trempez soigneusement les sections dans de l’eau sans RNase pendant 30 secondes pour enlever complètement l’OCT.
Ensuite, distribuez 50 microlitres de tache commerciale de section congelée LCM sur la section et incubez à température ambiante pendant 10 secondes. Égoutter la section en plaçant le bord de la lame sur du papier de soie absorbant. Rincer la section à 100 % d’éthanol pendant 30 secondes pour éliminer tout excès de tache.
Plonger les sections osseuses dans un deuxième tube contenant 100% d’éthanol pendant 30 secondes, puis les transférer à 100% xylène pendant 30 secondes. Mettez le film adhésif sur une glissière en verre sec comme support, en prenant soin de placer le film aussi plat que possible. Après cela, placez une glissière de trame de membrane de PET sur le film et appuyez brièvement un doigt ganté sur la membrane pour l’attacher au film.
Cet échantillon sera pris en sandwich entre la membrane et le film adhésif. Le film adhésif ne doit pas être plié ou froissé et il ne doit pas y avoir de bulles d’air entre le film et la membrane. Commencez par utiliser le décontamination de surface pour nettoyer le support du bouchon d’extrémité de scène.
Chargez la glissière dans le porte-glissière et les bouchons dans le support du bouchon. Ensuite, ajustez la mise au point et obtenez une vue d’ensemble de diapositives avec l’objectif 1.25x. Passer à l’objectif 40x et ajuster la mise au point.
À l’aide de la vue d’ensemble de la diapositive, choisissez le domaine d’intérêt. Ensuite, ajustez les paramètres laser comme indiqué ici, en vous assurant d’optimiser ces paramètres pour chaque objectif. Si le laser ne coupe pas l’échantillon, augmenter la puissance laser.
Choisissez des cellules ostéoblastes, ostéocites et os dans l’os fœmoral distal cancellous ou cortical basé sur des critères morphologiques. Tracez une ligne pour la trajectoire laser plus loin des cellules cibles afin de minimiser les dommages causés par le laser UV. Si le laser ne coupe pas l’échantillon, appliquez le laser plus d’une fois ou inspectez la cible pour décelé les taches de coupures incomplètes et utilisez l’option déplacer et couper pour couper le tissu à ces endroits.
Recueillir chaque type de cellule dans un bouchon de tube séparé de 0,5 millilitre. Tout d’abord, distribuez 50 microlitres du tampon de lyse contenant du bêta mercaptoéthanol dans le bouchon du tube de collecte. Lyse l’échantillon en le pippetting de haut en bas dans le bouchon pendant une minute.
Ensuite, faites tourner le lysate et ajoutez 00 microlitres du tampon de lyse contenant du bêta-mercaptoéthanol au tube. Pour chaque diapositive, préparez un tube de microcentrifugeuse étiqueté avec 350 microlitres du tampon de lyse contenant du mercaptoéthanol bêta. Utilisez les sections restantes après le LCM pour extraire l’ARN.
Séparez soigneusement le film de la membrane et lysez l’échantillon en pippetting lentement le tampon de lyse sur la section plusieurs fois. Ensuite, placez les échantillons de lysate sur la glace sèche et rangez-les à moins 80 degrés Celsius. Lorsqu’ils sont prêts à continuer, décongeler les lysates à température ambiante.
Après cela, transférez les lysates des cellules récoltées par LCM dans les tubes de collecte vers de nouveaux tubes de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre et extrayez l’ARN selon les instructions du fabricant. Dans cette étude, un protocole LCM est développé pour obtenir une quantité suffisante d’ARN de haute qualité pour l’analyse de l’expression des gènes dans les cellules osseuses des fémurs de souris. LCM est effectué à l’aide d’un système LCM qui utilise la gravité pour la collecte d’échantillons.
Le rendement et l’intégrité de l’ARN isolé ont été mesurés à l’aide de l’électrophoresis microcapllaire. La différence de qualité et de quantité d’ARN obtenue à l’aide de différents protocoles de lyse peut être vue ici dans le gel représentatif et les électrophéogrammes. Lorsque l’échantillon est lysé en pippetting de haut en bas dans le bouchon pendant une minute, il est possible d’isoler environ 8,5 nanogrammes d’ARN à partir d’un millimètre carré de tissu osseux microdissected.
La valeur RIN est de 8,60. Alternativement, LCM est effectué à l’aide d’un système LCM qui utilise une impulsion laser déconcentré, qui catapulte le matériau dans le bouchon adhésif en surplomb. Pour les os congelés frais, il est possible d’isoler environ 1,6 nanogramme d’ARN d’un millimètre carré de tissu osseux microdissé.
La valeur RIN en est une. En conclusion, les choses les plus importantes à retenir dans cette procédure sont d’appliquer le protocole permanent de la bonne manière, d’empêcher le séchage complet des sections dans le complexe sandwich, d’utiliser un système de MCL approprié et de ne pas dépasser les délais de récolte des cellules. Une fois que vous avez isolé l’ARN des cellules capturées, vous pouvez utiliser l’ARN pour le profilage d’expression, par exemple, par recherche d’ARN.
Enfin, nous tenons à vous rappeler que le xylène et le bêta-mercaptoéthanol sont des substances dangereuses qui doivent être manipulées sous une hotte. En outre, s’il vous plaît prendre les précautions appropriées lors de la manipulation de l’azote liquide et aussi les lames cryotome.
