Задумывались ли вы об использовании силы микроперехвления лазерного захвата для анализа экспрессии генов в конкретных костных клетках в их естественной среде обитания? Здесь мы описываем протокол, который позволит вам получить достаточное количество высококачественной РНК от криков костей мыши. Эта технология является отличным инструментом для изучения изменений экспрессии генов в конкретных костных клетках в генетически модифицированных моделях мыши или в моделях заболеваний.
Описанный здесь протокол ориентирован на кости мыши, но может быть использован для изучения на месте экспрессии генов в клетках любой твердой ткани любого вида. Помочь продемонстрировать эту процедуру будет Кристиана Шулер, техник из моей лаборатории. После усытворения мышей путем экссангинации под общим наркозом, удалить целые бедренной кости быстро.
Используйте скальпель и бумажные полотенца для очистки бедренной кости окружающих мягких тканей. Далее, залить оптимальной резки температуры соединения в встраивание формы и место бедренной кости в нижней части встраивания формы. Привязать заморозить образцы в жидком азоте.
После того, как образцы полностью заморожены, завернуть их в фольгу и передать их на сухой лед в морозильную камеру. Храните их при температуре минус 80 градусов по Цельсию до готовности к дальнейшей обработке. Во-первых, установите температуру в криостате до минус 19 градусов по Цельсию, а температуру держателя блока до минус 17 градусов по Цельсию.
Затем протрите интерьер криостата 70%этанолом. Поместите одноразовое лезвие для твердых тканей, стеклянные слайды, и подходящий инструмент в криостат, чтобы охладить, и держать их внутри криостата в течение всего периода секции. Перенесите замороженный блок ткани на сухой лед в криостат и дайте ему эквилибрировать в течение по крайней мере 10 минут.
Затем нажмите на дно встраиваемой формы, чтобы вытолкнуть блок OCT из формы. Нанесите достаточно OCT среды на держатель блока придерживаться блока к нему и ждать, пока среда OCT замерзает полностью. После этого поместите держатель блока в держатель объекта и затяните его на место.
Отрегулируйте положение лезвия и обрежьте блок 15-микрометровым шагом для удаления OCT, покрывающего образец. Отрегулируйте криостат для генерации восьмимиметровых секций и вырежьте две-три криозеции, которые будут отброшены. Поместите клейкую пленку на блок и используйте подходящий инструмент, чтобы приклеить пленку к блоку.
Теперь сделайте разрез медленно и с постоянной скоростью, удерживая секцию за пленкой. Поместите пленку с образцом, обращенным вверх, на предварительно охлажденое стеклянное горку на криобаре в криостате, чтобы избежать оттаивания образца. Используйте ленту, чтобы зафиксировать пленку на стеклянной горке для облегчения окрашивания.
В дымовой капот, подготовить необходимые решения этанола, RNase свободной воды и ксилена на льду, как указано в текстовом протоколе. Инкубировать секции в 95% этанола в течение 30 секунд. Затем осторожно окуните секции в воду без RNase в течение 30 секунд, чтобы полностью удалить OCT.
Далее, обойтись 50 микролитров коммерческих LCM замороженных пятно раздела на секцию и инкубировать при комнатной температуре в течение 10 секунд. Слейте раздел, поместив край слайда на абсорбянтной бумаге ткани. Промыть раздел в 100% этанола в течение 30 секунд, чтобы удалить излишки пятна.
Погрузите костные секции во вторую трубку, содержащую 100% этанол в течение 30 секунд, а затем перенесите их на 100% ксилена в течение 30 секунд. Положите клейкую пленку на сухую стеклянную горку в качестве опоры, заботясь о том, чтобы поместить пленку как можно более плоской. После этого поместите рамку ПЭТ мембраны слайд на пленку и кратко нажмите перчаточный палец на мембрану, чтобы прикрепить его к пленке.
Этот образец будет зажат между мембраной и клейкой пленкой. Клейкая пленка не должна быть сложена или морщинистой и не должно быть пузырьков воздуха между пленкой и мембраной. Начните с использования поверхностного обеззараживания для очистки держателя крышки конца сцены.
Загрузите слайд в держатель слайда и колпачки в держатель крышки. Далее отрегулируйте фокус и приобретете обзор слайдов с целью 1.25x. Измените цель 40x и отрегулируйте фокус.
Используя обзор слайда, выберите область, интересную. Затем отрегулируйте параметры лазера, как показано здесь, убедившись, что оптимизировать эти параметры для каждой цели. Если лазер не может вырезать образец, увеличить мощность лазера.
Выберите остеобласт, остеоциты и клетки костной подкладки в дистальной бедренной канцеляциозной или корковой кости на основе морфологических критериев. Нарисуйте линию для лазерного пути дальше от целевых ячеек, чтобы свести к минимуму ущерб от УФ-лазера. Если лазер не в состоянии сократить образец, применять лазер более одного раза или проверить цель на пятна неполных сокращений и использовать двигаться и вырезать возможность сократить ткани в этих местах.
Соберите каждый тип ячейки в отдельной крышке трубки 0,5 миллилитров. Во-первых, обойтись 50 микролитров лиза буфера, содержащего бета меркаптоэтанол в крышку трубки сбора. Lyse образец, pippetting его вверх и вниз в крышку в течение одной минуты.
Затем свяйте лизат и добавьте в трубку 00 микролитров буфера лиза, содержащего бета-меркаптоэтанол. Для каждого слайда подготовьте помеченную микроцентрифуговую трубку с 350 микролитров буфера лиза, содержащего бета меркаптоэтанол. Используйте разделы, оставшиеся после LCM для извлечения РНК.
Тщательно отделить пленку от мембраны и подлизать образец, медленно pippetting лиза буфера на раздел несколько раз. Затем положите лисатные образцы на сухой лед и храните их при температуре минус 80 градусов по Цельсию. Когда готовы к продолжению, оттаивать лизаты при комнатной температуре.
После этого перенесите лизаты из клеток, собранных LCM в коллекторских трубках, в новые 1,5-миллилитровые микроцентрифуги и извлекайте РНК в соответствии с инструкциями производителя. В этом исследовании разработан протокол LCM для получения достаточного количества высококачественной РНК для анализа экспрессии генов в костных клетках бедренной кости мыши. LCM выполняется с использованием системы LCM, которая использует гравитацию для сбора образцов.
Урожайность и целостность изолированной РНК измерялась с помощью микрокапильярной электрофорезы. Разница в качестве РНК и количестве, полученных с помощью различных протоколов лиза, можно увидеть здесь, в репрезентативном геле и электроферограммах. Когда образец лизается путем pippetting вверх и вниз в крышке в течение одной минуты, можно изолировать примерно 8,5 нанограмм РНК от одного квадратного миллиметра микродиссектированных костной ткани.
Значение RIN составляет 8,60. Кроме того, LCM выполняется с помощью системы LCM, которая использует дефокусированную лазерную пульс, которая катапультирует материал в нависающий клей крышкой. Для свежих замороженных костей можно изолировать примерно 1,6 нанограмма РНК от одного квадратного миллиметра микродиссектной костной ткани.
Значение RIN является одним. В заключение, наиболее важными вещами, которые нужно помнить в этой процедуре, являются правильное применение протокола стоя, предотвращение полного высыхания секций в сэндвич-комплексе, использование соответствующей системы LCM и не превышение сроков сбора клеток. После того как вы изолировали РНК из захваченных ячеек, вы можете использовать РНК для профилирования выражения, например, путем поиска РНК.
Наконец, мы хотели бы напомнить вам, что ксилен и бета-меркаптоэтанол являются опасными веществами, которые должны быть обработаны под капотом. Кроме того, пожалуйста, примите соответствующие меры предосторожности при обработке жидкого азота, а также криотомных лезвий.
