Haben Sie schon einmal darüber nachgedacht, die Kraft der Laser-Capture-Mikrodissektion für die Analyse der Genexpression in bestimmten Knochenzellen in ihrer natürlichen Umgebung zu nutzen? Hier beschreiben wir ein Protokoll, mit dem Sie ausreichende Mengen an hochwertiger RNA aus Kryosektionen von Mausknochen erhalten können. Diese Technologie ist ein großartiges Werkzeug, um Veränderungen in der Genexpression in bestimmten Knochenzellen in gentechnisch veränderten Mausmodellen oder in Krankheitsmodellen zu untersuchen.
Das hier beschriebene Protokoll konzentriert sich auf Mausknochen, kann aber verwendet werden, um in situ eine Genexpression in Zellen von jedem Hartgewebe jeder Spezies zu untersuchen. Um dieses Verfahren zu demonstrieren, hilft Christiane Schueler, eine Technikerin aus meinem Labor. Nach der Einschläferne Mäuse durch Exsanguination unter Vollnarkose, entfernen Sie ganze Oberschenkelknochen schnell.
Verwenden Sie ein Skalpell und Papiertücher, um die Oberschenkelknochen der umgebenden Weichgewebe zu reinigen. Als nächstes gießen Sie die optimale Schnitttemperaturverbindung in die Einbettform und legen Sie die Oberschenkelknochen in den Boden der Einbettformen. Fangen Sie die Proben in flüssigem Stickstoff ein.
Sobald die Proben vollständig eingefroren sind, wickeln Sie sie in Folie und übertragen Sie sie auf Trockeneis in einen Gefrierschrank. Lagern Sie sie bei minus 80 Grad Celsius, bis sie zur Weiterverarbeitung bereit sind. Stellen Sie zunächst die Temperatur im Kryostat auf minus 19 Grad Celsius und die Temperatur des Blockhalters auf minus 17 Grad Celsius ein.
Als nächstes wischen Sie das Innere des Kryostats mit 70% Ethanol ab. Legen Sie die Einwegklinge für hartes Gewebe, die Glasgletten und ein passendes Werkzeug in den Kryostat, um sie abzukühlen, und halten Sie sie für die Dauer des Schnitts im Kryostat. Den gefrorenen Gewebeblock auf Trockeneis in den Kryostat geben und mindestens 10 Minuten ausgrenzen lassen.
Drücken Sie dann den Boden der Einbettform, um den OCT-Block aus der Form zu schieben. Tragen Sie genügend OCT-Medium auf den Blockhalter auf, um den Block daran zu kleben und zu warten, bis das OCT-Medium vollständig einfriert. Danach den Blockhalter in den Objekthalter legen und festanlegen.
Passen Sie die Klingenposition an und trimmen Sie den Block in 15-Mikrometer-Schnittschritten, um das OCT zu entfernen, das die Probe bedeckt. Stellen Sie den Kryostat so ein, dass acht Mikrometerabschnitte erzeugt werden, und schneiden Sie zwei bis drei Kryosektionen, die verworfen werden. Legen Sie Klebefolie auf den Block und verwenden Sie das Montagewerkzeug, um die Folie am Block zu befestigung.
Machen Sie nun einen Schnitt langsam und mit konstanter Geschwindigkeit, während Sie den Abschnitt durch den Film halten. Platzieren Sie den Film mit der Probe nach oben auf einer vorgekühlten Glasrutsche auf der Kryobar innerhalb des Kryostats, um ein Auftauen der Probe zu vermeiden. Verwenden Sie Klebeband, um den Film an der Glasfolie zu befestigen, um die Färbung zu erleichtern.
In einer Dunstabzugshaube können Sie die notwendigen Lösungen für Ethanol, RNase-freies Wasser und Xylol auf Eis vorbereiten, wie im Textprotokoll beschrieben. Inkubieren Sie die Abschnitte in 95% Ethanol für 30 Sekunden. Dann tauchen Sie die Abschnitte vorsichtig in RNase-freies Wasser für 30 Sekunden, um das OCT vollständig zu entfernen.
Als nächstes geben Sie 50 Mikroliter kommerziellen LCM gefrorenen Abschnitt Fleck auf den Abschnitt und inkubieren bei Raumtemperatur für 10 Sekunden. Entleeren Sie den Abschnitt, indem Sie den Rand des Schlittens auf saugfähiges Gewebepapier legen. Spülen Sie den Abschnitt in 100%Ethanol für 30 Sekunden, um überschüssige Flecken zu entfernen.
Tauchen Sie die Knochenabschnitte 30 Sekunden lang in ein zweites Rohr ein, das 100% Ethanol enthält, und übertragen Sie sie dann 30 Sekunden lang auf 100%Xylol. Als Stütze Klebefolie auf eine trockene Glasrutsche legen und darauf achten, die Folie so flach wie möglich zu platzieren. Legen Sie anschließend eine PET-Membranrahmenfolie auf die Folie und drücken Sie kurz einen Handfinger auf die Membran, um sie an der Folie zu befestigen.
Diese Probe wird zwischen der Membran und der Klebefolie eingeklemmt. Die Klebefolie sollte nicht gefaltet oder faltig sein und es sollte keine Luftblasen zwischen der Folie und der Membran geben. Beginnen Sie mit Oberflächendekontamination, um den Bühnenendkappenhalter zu reinigen.
Legen Sie den Schlitten in den Schiebehalter und die Kappen in den Kappenhalter. Passen Sie als Nächstes den Fokus an und erhalten Sie eine Folienübersicht mit dem 1,25-fachen Ziel. Wechseln Sie zum 40x-Objektiv und passen Sie den Fokus an.
Wählen Sie in der Folienübersicht den Interessenbereich aus. Passen Sie dann die Laserparameter wie hier gezeigt an, um sicherzustellen, dass diese Parameter für jedes Objektiv optimiert werden. Wenn der Laser die Probe nicht schneidet, erhöhen Sie die Laserleistung.
Wählen Sie Osteoblasten, Osteoziten und Knochenfutterzellen in distalen femoralen Cancellous oder kortikalen Knochen auf der Grundlage morphologischer Kriterien. Zeichnen Sie eine Linie für den Laserpfad weiter weg von den Zielzellen, um die Schäden durch den UV-Laser zu minimieren. Wenn der Laser die Probe nicht schneidet, wenden Sie den Laser mehr als einmal an oder überprüfen Sie das Ziel auf Flecken unvollständiger Schnitte und verwenden Sie die Option "Bewegen und Schneiden", um das Gewebe an diesen Stellen zu schneiden.
Sammeln Sie jeden Zelltyp in einer separaten 0,5-Milliliter-Rohrkappe. Geben Sie zunächst 50 Mikroliter des Lysepuffers, der Beta-Mercaptoethanol enthält, in die Kappe des Sammelrohrs. Lyse die Probe, indem Sie es nach oben und unten in der Kappe für eine Minute.
Als nächstes drehen Sie das Lysat herunter und fügen 00 Mikroliter des Lysepuffers, der Beta-Mercaptoethanol enthält, in die Röhre ein. Für jeden Schlitten ein beschriftetes Mikrozentrifugenrohr mit 350 Mikrolitern des Lysepuffers mit Beta-Mercaptoethanol vorbereiten. Verwenden Sie die nach dem LCM verbleibenden Abschnitte, um RNA zu extrahieren.
Trennen Sie den Film vorsichtig von der Membran und lysieren Sie die Probe, indem Sie den Lysepuffer mehrmals langsam auf den Abschnitt pfeifen. Dann die Lysatproben auf Trockeneis legen und bei minus 80 Grad Celsius lagern. Wenn Sie bereit sind, fortzufahren, tauen Sie die Lysate bei Raumtemperatur auf.
Danach übertragen Sie die Lysate aus LCM-geernteten Zellen in den Sammelröhrchen auf neue 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhren und extrahieren RNA nach herstellerspezifischen Anweisungen. In dieser Studie wurde ein LCM-Protokoll entwickelt, um eine ausreichende Menge an hochwertiger RNA für die Genexpressionsanalyse in Knochenzellen von Mausfemuren zu erhalten. LCM wird mit einem LCM-System durchgeführt, das die Schwerkraft für die Probensammlung verwendet.
Die Ausbeute und Integrität isolierter RNA wurde mit mikrokapillarer Elektrophorese gemessen. Der Unterschied in der RNA-Qualität und -Menge, der mit verschiedenen Lyseprotokollen gewonnen wird, ist hier in den repräsentativen Gel- und Elektropherogrammen zu sehen. Wenn die Probe durch Pippetting in der Kappe für eine Minute nach oben und unten lysiert wird, ist es möglich, etwa 8,5 Nanogramm RNA von einem Quadratmillimeter mikroseziertem Knochengewebe zu isolieren.
Der RIN-Wert ist 8,60. Alternativ wird LCM mit einem LCM-System durchgeführt, das einen defokussierten Laserpuls verwendet, der das Material in die überhängende Klebekappe katapultiert. Bei frischen gefrorenen Knochen ist es möglich, etwa 1,6 Nanogramm RNA aus einem Quadratmillimeter mikroseziertem Knochengewebe zu isolieren.
Der RIN-Wert ist eins. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die wichtigsten Dinge, die in diesem Verfahren zu beachten sind, das standende Protokoll in der richtigen Weise anwenden, das vollständige Austrocknen von Abschnitten im Sandwichkomplex verhindern, ein geeignetes LCM-System verwenden und die Fristen für die Ernte der Zellen nicht überschreiten. Sobald Sie RNA aus den erfassten Zellen isoliert haben, können Sie die RNA zum Expressionsprofiling verwenden, z. B. durch RNA seek.
Abschließend möchten wir Sie daran erinnern, dass Xylol und Beta-Mercaptoethanol gefährliche Stoffe sind, die unter einer Haube behandelt werden müssen. Darüber hinaus treffen Sie bitte geeignete Vorsichtsmaßnahmen beim Umgang mit flüssigem Stickstoff und auch den Kryotomklingen.
