הפרוטוקול שלנו יכול לשמש כדי לחקור את תנועתיות לוקליזציה של organelles אסטרוציטים או חלבונים תחת סביבות חוץ תאיות מבוקרות מצבי מחלה קלה. שלא כמו ההכנות הקבועות של MHA, המספקות תמונות בודדות של לוקליזציה של חלבונים ואברונים, טכניקת ההדמיה החיה שלנו יכולה לשמש לניתוח דינמיקת חלקיקים באסטרוציטים חיים בודדים. יום לפני אסטרוציטים זרעי transfection בצפיפות המתאימה להדמיה ב 24 עד 48 שעות לאחר transfection.
מדללים את רגנט ליפוקציה במדיום סרום מופחת לריכוז הניסוי המתאים. לדלל חמישה מיקרוגרם של DNA טוהר גבוה ב 250 microliters של מדיום סרום מופחת ולהוסיף חמישה microliters של reagent משפר lipofection לצינור. מערבבים את רגנט lipofection עם נפח שווה של תערובת משפר lipofection DNA להדגיר את הפתרון במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
בסוף הדגירה, להסיר את supernatant מתרבות האסטרוציטים ולהוסיף 100 microliters של תערובת transfection dropwise לתאים. לאחר שש שעות ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני, להחליף את קומפלקס transfection עם נפח מתאים של תרבות אסטרוציטים בינוני ולהחזיר את התאים החממה תרבות התא במשך 24 עד 72 שעות נוספות. 30 דקות לפני ההדמיה, לדלל בדיקה תיוג lysosomal מתאים ב 200 microliters של מדיום תרבות אסטרוציטים לריכוז עבודה של micromolar אחד ולתייג את האסטרוציטים עם בדיקה במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.
לאחר מכן לשטוף את התאים פעם אחת עם בינוני תרבות אסטרוציטים חם ולהחליף את לשטוף עם מדיום הדמיה. מיד לאחר תיוג הגשוש, מניחים את מיכל תרבות האסטרוציטים במתאם המתאים בשלב המיקרוסקופ ובשימוש באור פלואורסצנטי של EBI, מאתרים את התאים המבטאים חלבונים פלואורסצנטיים או בדיקה. השתמש במצלמה הדיגיטלית כדי לכוונן את תאורת הדגימה הפלואורסצננטית כדי להמחיש את התאים הנבחרים ולהתאים את המוקד ולהגדיל את התצוגה לתא בודד.
לאחר מכן השתמש בפונקציות זום והתמקדות מוגדרת כדי להשיג סידרת זמן-lapse אחת של מחסנית Z בתדירות של מסגרת אחת כל שתי שניות עבור מרווחי זמן הנעים בין 300 ל- 500 שניות. שמור וייצא את התמונות לשגות בזמן כקבצי מחסנית AVI או TIFF. כדי לנתח את התמונות לשגות בזמן, פתחו את רצף התמונות של זמן ההפוגה ב- ImageJ או בפיג'י ולהשתמש בכלי פיצול ערוץ כדי לפצל את הערוצים.
בתדמית הערוץ הירוק של שמונה סיביות, השתמש בכלי קו מקופל כדי לעקוב אחר קו לאורך מסלולי החלקיקים באמצעות אותה מוסכמה כיוונית רצויה עבור כל הסרטים, כך שהקוטביות עקבית בתוך כל התאים הנחקרים. לחץ פעמיים על הכלי קו כדי להתאים את רוחב הקו כדי להתאים את עובי המסלול ולהפעיל את המאקרו צייר Kymo של תוסף תיבת כלים Kymo באמצעות רוחב קו של 10. תופיע בקשה המבקשת לכייל את התמונה בזמן ובמקום.
לאחר כיול, קימוגרפים ייווצרו ו ניתן לשמור אותם כקבצי TIFF. כדי להקצות מסלולי חלקיקים, השתמש בכלי קו מקופל כדי לעקוב באופן ידני אחר כל חלקיק בקימוגרף למשך כל תקופת הרכישה ולהשתמש במנהל החזר ההשקעות כדי לתעד כל מסלול חלקיקים כאזור מעניין. שמור את כל אזורי העניין לכל וידאו לשגות זמן לניתוח נוסף ולהפעיל את המאקרו לנתח Kymo של תוסף תיבת כלים Kymo.
ייפתח חלון המבקש להגדיר את הכיוון החיצוני של תנועת החלקיקים מגרעין תא העניין מהתפריט הנפתח. יש להגדיר את מהירות המגבלה בהתאם לרגישות התוכנה לכל מטען מעניין ויש להתאים את רוחב הקו כך שיתאימו לעובי של כל מסלול חלקיקי. רשום את כל הנתונים ואת יומן קואורדינטות אקסטרפולציה צריך להיות לחישוב של הפרמטרים השונים הובלת מטען.
לחץ על אישור. הנתונים המחושבים עבור הרצועות הבודדות יאגרו לאחר מכן לכל קימוגרף ויישמרו בקבצי טקסט הספציפיים לכל תמונה. שילוב טיפול ציטוצינוס ערבינוסייד עם אסטרטגיית טיהור מבוססת טלטול מעשיר את טוהר תרבויות האסטרוציטים על פני פרוטוקולים מסורתיים הכוללים את צעד הטיהור בלבד.
transfection מבוסס Lipofection מאפשר ביטוי חולף של חלבונים ברמות אופטימליות עבור הדמיה של תאים חיים מבלי לגרום רעילות או להשפיע על הכדאיות אסטרוציטים. באופן דומה, השימוש בבדיקה פלואורסצנטית מאפשר תיוג מהיר ויעיל של אורגנים אנדוליזומליים חומציים למעקב אחר דינמיקת אורגנל ואסטרוציטים. ניתן להשתמש בנתונים של זמן לשגות מההדמיה כדי ליצור קימוגרפים העקובים אחר תנועת המטען בזמן ו בחלל.
בקימוגרף אלה, תנועת אנטרוגרד של המטען המצוין מיוצגת על ידי מסלולים עם מדרונות שליליים, בעוד תנועה מדרדרת מיוצגת על ידי מסלולים עם מדרונות חיוביים. מעולםים נייחים מופיעים כמסלולים אנכיים. בניתוח זה, כימות השטף של מטען מסוים דרך אזור של האסטרוציטים חשף הבדלים באחוז החלקיקים המודאליים בקרב מטענים אשר עשויים להיות מייצגים את תנועתיות קו הבסיס הרגיל שלהם באזור האסטרוציטים שבתוכם נרכשו הסרטים.
המיפוי המדויק של השינוי במיקום X, Y לאורך ציר הזמן המלא עבור כל חלקיק המתקבל מהקימוגרף יכול לשמש גם להערכת פרמטרי תנועה אחרים, כגון מהירות מטען ואורך ריצה. מכיוון שפרוטוקול זה דורש תרבויות אסטרוציטים באיכות גבוהה ותיוג מטען יעיל, יש להתאים את זמן הדגירה והרכישה של ה-transfection עבור כל פלסמיד או מטען של עניין. פרוטוקול זה יכול להיות שונה כדי לאפיין אירועי תחבורה אסטרוציטים בתגובה לנזק לתאים, רעילות, מוטציות פתוגניות, פעילות סינפטית, או שינויים בסביבה החוץ תאית.
