Il nostro protocollo può essere utilizzato per indagare la motilità e la localizzazione di organelli astrocitici o proteine sotto ambienti extracellulari controllati e stati di malattia lieve. A differenza dei preparati fissi MHA, che forniscono singole istantanee di localizzazione di proteine e organelli, la nostra tecnica di imaging dal vivo può essere utilizzata per analizzare la dinamica delle particelle nei singoli astrociti vivi. Il giorno prima del seme di trasfezione astrociti alla densità appropriata per l'imaging a 24-48 ore dopo la trasfezione.
Diluire il reagente di lipofezione in mezzo siero ridotto alla concentrazione sperimentale appropriata. Diluire cinque microgrammi di DNA ad alta purezza in 250 microlitri di mezzo siero ridotto e aggiungere cinque microlitri di reagente esaltatore di lipofezione al tubo. Mescolare il reagente lipofection con un volume uguale del mix di esaltatore lipofezione del DNA e incubare la soluzione per 15 minuti a temperatura ambiente.
Alla fine dell'incubazione, rimuovere il supernatante dalla coltura di astrociti e aggiungere 100 microlitri della miscela di trasfezione dropwise alle cellule. Dopo sei ore a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica, sostituire il complesso di trasfezione con un volume appropriato di terreno di coltura di astrociti e riportare le cellule all'incubatore di coltura cellulare per ulteriori 24-72 ore. 30 minuti prima dell'imaging, diluire una sonda di etichettatura lisosomiale adatta in 200 microlitri di mezzo di coltura di astrociti a una concentrazione di lavoro di un micromolare ed etichettare gli astrociti con una sonda per 30 minuti a 37 gradi Celsius.
Quindi lavare le cellule una volta con un mezzo di coltura di astrociti caldi e sostituire il lavaggio con un mezzo di imaging. Subito dopo l'etichettatura della sonda, posizionare il contenitore di coltura degli astrociti nell'adattatore appropriato sullo stadio del microscopio e utilizzando la luce a fluorescenza EBI, individuare le cellule che esprimono proteine fluorescenti o sonda. Utilizzare la fotocamera digitale per regolare l'illuminazione del campione fluorescente per visualizzare le celle selezionate e regolare la messa a fuoco e ingrandire una singola cella.
Quindi utilizzare le funzioni Zoom e Messa a fuoco definita per acquisire una singola serie time-lapse Z-stack con una frequenza di un fotogramma ogni due secondi per intervalli di tempo compresi tra 300 e 500 secondi. Salvare ed esportare le immagini time-lapse come file dello stack AVI o TIFF. Per analizzare le immagini time-lapse, aprite la sequenza di immagini time-lapse in ImageJ o Fiji e usate lo strumento Canale diviso per dividere i canali.
Nell'immagine del canale verde a otto bit, usate lo strumento Linea segmentata per tracciare una linea lungo le traiettorie delle particelle usando la stessa convenzione direzionale desiderata per tutti i filmati in modo che la polarità sia coerente all'interno e attraverso tutte le celle studiate. Fare doppio clic sull'utensile Linea per regolare la larghezza della linea in base allo spessore della traccia ed eseguire la macro Draw Kymo del plug-in Kymo ToolBox utilizzando una larghezza della linea di 10. Verrà visualizzata una richiesta di calibrazione dell'immagine nel tempo e nello spazio.
Una volta calibrati, i cimografi verranno generati e possono essere salvati come file TIFF. Per assegnare traiettorie di particelle, usate lo strumento Linea segmentata (Segmented Line) per tracciare manualmente ogni particella nel kymografo per l'intera durata dell'acquisizione e utilizzate il gestore del ROI per registrare ogni traiettoria di particelle come regione di interesse. Salva tutte le regioni di interesse per ogni video time-lapse per ulteriori analisi ed esegui la macro Analyze Kymo del plug-in Kymo ToolBox.
Si aprirà una finestra che chiede di definire la direzione verso l'esterno del movimento delle particelle dal nucleo della cella di interesse dal menu a discesa. La velocità limite deve essere definita in base alla sensibilità del software per ogni carico di interesse e la larghezza della linea deve essere regolata in base allo spessore di ciascuna traiettoria delle particelle. Log All Data e Log Extrapolated Coordinates devono essere per il calcolo dei vari parametri di trasporto merci.
Fare clic su Ok. I dati calcolati per le singole tracce verranno quindi raggruppati per kymograph e salvati in file di testo specifici di ogni immagine. La combinazione del trattamento della citosina arabinoside con la strategia di purificazione basata sullo scuotimento arricchisce la purezza delle colture di astrociti rispetto ai protocolli tradizionali che includono solo la fase di purificazione.
La trasfezione a base di lipofezione consente l'espressione transitoria delle proteine a livelli ottimali per l'imaging di cellule vive senza causare tossicità o influire sulla vitalità degli astrociti. Allo stesso modo, l'uso di una sonda fluorescente consente l'etichettatura rapida ed efficiente di organelli endolisosomiali acidi per il tracciamento della dinamica degli organelli e degli astrociti. I dati time-lapse dell'imaging possono essere utilizzati per generare cimografi che tracciano il movimento del carico nel tempo e nello spazio.
In questi cimografi, il movimento anterogrado del carico indicato è rappresentato da traiettorie con pendenze negative, mentre il movimento retrogrado è rappresentato da traiettorie con pendenze positive. Le vescicole stazionarie appaiono come traiettorie verticali. In questa analisi, la quantificazione del flusso di un carico specifico attraverso un'area dell'astrocita ha rivelato differenze nella percentuale di particelle modali tra i carichi che sono probabilmente rappresentative della loro normale motilità della linea di base nella regione dell'astrocita all'interno della quale sono stati acquisiti i film.
La mappatura precisa del cambiamento nella posizione X, Y lungo la scala di tempo completa per ogni particella ottenuta dal cimografo può anche essere usata per valutare altri parametri di movimento, come la velocità di carico e la lunghezza di corsa. Poiché questo protocollo richiede colture di astrociti di alta qualità ed efficiente etichettatura del carico, il tempo di incubazione del reagente di trasfezione e la tempistica di acquisizione dovrebbero essere regolati per ogni plasmide o carico di interesse. Questo protocollo può essere modificato per caratterizzare gli eventi di trasporto negli astrociti in risposta a danni cellulari, tossicità, mutazioni patogene, attività sinaptica o cambiamenti nell'ambiente intra o extracellulare.
