Наш протокол может быть использован для исследования подвижности и локализации астроцитических органелл или белков под контролируемой внеклеточной средой и легкими состояниями заболеваний. В отличие от фиксированных препаратов MHA, которые обеспечивают одиночные снимки локализации белка и органеллы, наш метод живой визуализации может быть использован для анализа динамики частиц в отдельных живых астроцитах. За день до трансфекции семян астроцитов при соответствующей плотности для визуализации на 24 до 48 часов после трансфекции.
Разбавить реагент липофеции в уменьшенной среде сыворотки до соответствующей экспериментальной концентрации. Разбавить пять микрограммов ДНК высокой чистоты в 250 микролитров уменьшенной среды сыворотки и добавить пять микролитров реагента липофека в трубку. Смешайте реагент липофекции с равным объемом смеси усилителя липофекции ДНК и инкубировать раствор в течение 15 минут при комнатной температуре.
В конце инкубации удалите супернатант из культуры астроцитов и добавьте в клетки 100 микролитров трансинфекционные смеси. После шести часов при 37 градусах По Цельсию и 5%углеродного диоксида, замените трансфектный комплекс соответствующим объемом среды культуры астроцитов и верните клетки в инкубатор клеточной культуры еще на 24-72 часа. За 30 минут до визуализации разбавляют подходящий лизосомальный зонд маркировки в 200 микролитров астроцитов культуры среды до рабочей концентрации одного микромолара и маркировать астроциты с зондом в течение 30 минут при 37 градусах цельсия.
Затем мыть клетки один раз с теплой астроцитов культуры среды и заменить мыть с изображением среды. Сразу же после маркировки зонда поместите контейнер культуры астроцитов в соответствующий адаптер на стадии микроскопа и с помощью EBI флуоресцентного света, найдите клетки, которые выражают флуоресцентные белки или зонд. Используйте цифровую камеру, чтобы настроить флуоресцентное освещение образца, чтобы визуализировать выбранные ячейки и настроить фокус и увеличить до одной ячейки.
Затем используйте функции увеличить и определенного фокуса, чтобы приобрести одну серию промежуток времени с частотой одного кадра каждые две секунды для временных интервалов от 300 до 500 секунд. Сохранить и экспортировать покадровые изображения в качестве файлов стека AVI или TIFF. Для анализа изображений замедленного действия откройте последовательность изображений замедленного действия в ImageJ или Fiji и используйте инструмент Split Channel для разделения каналов.
В восьми битном зеленом изображении канала используйте инструмент Segmented Line, чтобы проследить линию по траекториям частиц, используя ту же желаемую направленную конвенцию для всех фильмов, чтобы полярность была последовательной внутри и во всех изучаемых клетках. Дважды нажмите на инструмент Line, чтобы настроить ширину линии, чтобы соответствовать толщине трека и запустить draw Kymo макрос плагина Kymo ToolBox с использованием ширины линии 10. Появится запрос с просьбой откалибровать изображение во времени и пространстве.
После калибровки кимографы будут сгенерированы и могут быть сохранены в качестве файлов TIFF. Чтобы назначить траектории частиц, используйте инструмент Segmented Line, чтобы вручную отслеживать каждую частицу в кимографе в течение всего срока приобретения и использовать менеджер рентабельности инвестиций для записи каждой траектории частицы в качестве области интересов. Сохранить все регионы, представляющие интерес для каждого замедленного видео для дальнейшего анализа и запустить анализ Kymo макро плагина Kymo ToolBox.
Откроется окно с просьбой определить внешнее направление движения частиц из ядра ячейки, представляющих интерес, из меню высадки. Предельная скорость должна определяться в соответствии с чувствительностью программного обеспечения для каждого заинтересованного груза, а ширина линии должна быть скорректирована в соответствии с толщиной каждой траектории частицы. Для расчета различных параметров грузового транспорта должны быть экстраполированы координаты журнала «Все данные и журнал».
Нажмите Хорошо. Данные, рассчитанные для отдельных треков, затем объединяются для кимографа и сохраняются в текстовых файлах, характерных для каждого изображения. Сочетание цитозин арабинозидной обработки со стратегией очистки на основе встряхивания обогащает чистоту культур астроцитов по отношению к традиционным протоколам, которые включают только шаг очистки.
Липофекция на основе трансфекции позволяет преходящее выражение белков на уровнях, которые являются оптимальными для живой визуализации клеток, не вызывая токсичности или влияющих на жизнеспособность астроцитов. Аналогичным образом, использование флуоресцентного зонда позволяет быстро и эффективно маркировать кислые эндолизомальные органеллы для отслеживания динамики органелл и астроцитов. Данные замедленного действия изображения могут быть использованы для создания кимографов, отслеживая движение груза во времени и пространстве.
В этих кимографах антероградное движение указанного груза представлено траекториями с отрицательными склонами, а ретроградное движение представлено траекториями с положительными склонами. Стационарные пузырьки отображаются как вертикальные траектории. В этом анализе количественная оценка потока конкретного груза через область астроцита выявила различия в проценте модальных частиц среди грузов, которые, вероятно, являются репрезентативными для их нормальной подвижности базовой линии в области астроцита, в пределах которого были приобретены фильмы.
Точное отображение изменения положения X, Y по полной шкале времени для каждой частицы, полученной из кимографа, также может быть использовано для оценки других параметров движения, таких как скорость груза и длина бега. Поскольку этот протокол требует высококачественных культур астроцитов и эффективной маркировки грузов, время инкубации трансфекции реагентов и сроки приобретения должны быть скорректированы для каждой плазмиды или груза, представляющих интерес. Этот протокол может быть изменен для характеристики транспортных событий в астроцитах в ответ на повреждение клеток, токсичность, патогенные мутации, синаптической активности или изменения внутриклеточной или внеклеточной среды.
