Protokolümüz, astrositik organellerin veya proteinlerin kontrollü hücre dışı ortamlar ve hafif hastalık durumları altında hareketliliğini ve lokalizasyonunu araştırmak için kullanılabilir. Protein ve organel lokalizasyonunun tek bir anlık görüntüsünü sağlayan MHA sabit preparatlarının aksine, canlı görüntüleme tekniğimiz bireysel canlı astrositlerde parçacık dinamiklerini analiz etmek için kullanılabilir. Transfeksiyon tohumu astrositlerinden bir gün önce 24-48 saat sonra görüntüleme için uygun yoğunlukta astrositler.
Seyreltmek dudak reaktifi uygun deneysel konsantrasyon azaltılmış serum orta. Azaltılmış serum ortamının 250 mikrolitresinde beş mikrogram yüksek saflıkta DNA seyreltin ve tüpe beş mikrolitre lipofection arttırıcı reaktif ekleyin. Lipofection reaktifini DNA lipofection arttırıcı karışımının eşit hacmiyle karıştırın ve çözeltiyi oda sıcaklığında 15 dakika kuluçkaya yatırın.
Kuluçka sonunda, astrosit kültüründen supernatant çıkarın ve hücrelere dropwise transfection karışımı 100 mikrolitre ekleyin. 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksit altı saat sonra, astrosit kültür ortamı uygun bir hacim ile transfeksiyon kompleksi değiştirin ve ek bir 24 ila 72 saat için hücre kültürü kuluçka hücreleri iade. Görüntülemeden 30 dakika önce, 200 mikrolitre astrosit kültür ortasında uygun bir lisozomal etiketleme sondasını bir mikromolar üzerinde çalışmaya niçin seyreltin ve astrositleri 37 santigrat derecede 30 dakika boyunca bir sonda ile etiketleyin.
Daha sonra hücreleri sıcak astrosit kültür ortamı ile bir kez yıkayın ve görüntüleme ortamı ile yıkama değiştirin. Sonda etiketlemehemen sonra, mikroskop aşamasında uygun adaptör içine astrosit kültür konteyner yerleştirin ve EBI floresan ışık kullanarak, floresan proteinler veya prob ifade hücreleri bulmak. Seçili hücreleri görselleştirmek ve odağı ayarlamak ve tek bir hücreye yakınlaştırmak için floresan örnek aydınlatmayı ayarlamak için dijital kamerayı kullanın.
Daha sonra 300 ile 500 saniye arasında değişen zaman aralıkları için her iki saniyede bir kare lik bir sıklıkta tek bir Z yığını zaman atlamalı seri elde etmek için Yakınlaştırma ve Kesin Odaklama işlevlerini kullanın. Hızlandırılmış görüntüleri AVI veya TIFF yığın dosyaları olarak kaydedin ve dışa aktarın. Hızlandırılmış görüntüleri analiz etmek için ImageJ veya Fiji'deki hızlandırılmış görüntü sırasını açın ve kanalları bölmek için Split Channel aracını kullanın.
Sekiz bit yeşil kanal görüntüsünde, kutupluluk incelenen tüm hücreler içinde ve arasında tutarlı olacak şekilde tüm filmler için aynı istenilen yön kuralını kullanarak parçacıkların yörüngeleri boyunca bir çizgi izlemek için Segmented Line aracını kullanın. Parçanın kalınlığına uyacak şekilde çizgi genişliğini ayarlamak için Çizgi aracını çift tıklatın ve 10 çizgi genişliği kullanarak Kymo ToolBox eklentisinin Kymo'nun Beraberlik Kymo makrosu çalıştırın. Görüntüyü zaman ve mekanda kalibre etmek isteyen bir istem görüntülenir.
Kalibre edildikten sonra, kymographs oluşturulur ve TIFF dosyaları olarak kaydedilebilir. Parçacık yörüngeleri atamak için, satın alma süresi boyunca kymograph'taki her parçacığı el ile izlemek için Segmented Line aracını kullanın ve her parçacık yörüngesini ilgi alanı olarak kaydetmek için YG yöneticisini kullanın. Daha fazla analiz için her zaman atlamalı video başına ilgi tüm bölgeleri kaydedin ve Kymo ToolBox eklentisinin Analiz Kymo makro çalıştırın.
Açılan menüden ilgi hücresinin çekirdeğinden parçacık hareketinin dışa doğru yönünü tanımlamak isteyen bir pencere açılır. Sınır hızı, her bir ilgi kargosu için yazılımın hassasiyetine göre tanımlanmalı ve hat genişliği her parçacık yörüngesinin kalınlığına uyacak şekilde ayarlanmalıdır. Log Tüm Veriler ve Log Ekstrapolated Koordinatlar çeşitli kargo taşıma parametrelerinin hesaplanması için olmalıdır.
Tamam'ı tıklatın. Tek tek parçalar için hesaplanan veriler daha sonra kymograph başına biraraya gelir ve her görüntüye özgü metin dosyalarına kaydedilir. Sitozin arabinoside tedavi ile sallayarak tabanlı arınma stratejisi birleştirerek sadece arınma adımı içeren geleneksel protokoller üzerinde astrosit kültürlerin saflık zenginleştirir.
Lipofection tabanlı transfeksiyon toksisite neden olmadan canlı hücre görüntüleme için en uygun düzeyde proteinlerin geçici ifade sağlar veya astrosit canlılık etkilemez. Benzer şekilde, floresan sonda kullanımı organel dinamikleri ve astrositlerin izlenmesi için asidik endolysomal organellerin hızlı ve verimli etiketlemeizin sağlar. Görüntülemeden elde edilen hızlandırılmış veriler, zaman ve mekandaki kargo hareketini izleyen kymograflar oluşturmak için kullanılabilir.
Bu kymograflarda, belirtilen kargonun anterograd hareketi negatif eğimli yörüngelerle, retrograd hareketi ise pozitif eğimli yörüngelerle temsil edilir. Sabit veziküller dikey yörüngeler olarak görünür. Bu analizde, belirli bir kargonun akının astrosit in bir alanı üzerinden ölçülmesi, filmlerin edinildiği astrosit bölgesinde normal taban çizgisi hareketliliğini temsil eden yükler arasındaki modal partiküllerin yüzdesi arasındaki farklılıkları ortaya koymuştur.
Kymograph'tan elde edilen her bir parçacık için x, y pozisyonundaki değişimin tam zaman ölçeği boyunca kesin eşleneği, kargo hızı ve çalışma uzunluğu gibi diğer hareket parametrelerini değerlendirmek için de kullanılabilir. Bu protokol yüksek kaliteli astrosit kültürleri ve verimli kargo etiketlemegerektirdiğinden, transfeksiyon reaktif kuluçka süresi ve satın alma zaman çizelgesi ilgi her plazmid veya kargo için ayarlanmalıdır. Bu protokol, hücre hasarı, toksisite, patojenik mutasyonlar, sinaptik aktivite veya hücre içi veya hücre dışı ortamdaki değişikliklere yanıt olarak astrositlerdeki taşıma olaylarını karakterize etmek için değiştirilebilir.
