Nosso protocolo pode ser usado para investigar a motilidade e localização de organelas astrócticas ou proteínas em ambientes extracelulares controlados e estados de doenças leves. Ao contrário das preparações fixas do MHA, que fornecem instantâneos únicos de localização de proteínas e organelas, nossa técnica de imagem ao vivo pode ser usada para analisar a dinâmica das partículas em astrócitos vivos individuais. Um dia antes da transfecção de astrócitos com a densidade apropriada para imagem em 24 a 48 horas após a transfecção.
Diluir o reagente de lipofecção em meio soro reduzido à concentração experimental apropriada. Diluir cinco microgramas de DNA de alta pureza em 250 microliters de meio soro reduzido e adicionar cinco microliters de reagente de lipofecção ao tubo. Misture o reagente de lipofecção com um volume igual da mistura de melhorador de lipofecção de DNA e incubar a solução por 15 minutos à temperatura ambiente.
No final da incubação, remova o sobrenasciente da cultura astrócito e adicione 100 microliters da mistura de transfecção dropwise às células. Após seis horas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono, substitua o complexo de transfecção por um volume apropriado de meio de cultura de astrócito e devolva as células à incubadora de cultura celular por mais 24 a 72 horas. 30 minutos antes da imagem, diluir uma sonda de rotulagem lysosômica adequada em 200 microliters de cultura de astrócito para uma concentração de trabalho de um micromolar e rotular os astrócitos com uma sonda por 30 minutos a 37 graus Celsius.
Em seguida, lave as células uma vez com meio de cultura de astrócito quente e substitua a lavagem por meio de imagem. Imediatamente após a rotulagem da sonda, coloque o recipiente de cultura de astrócito no adaptador apropriado no estágio do microscópio e usando luz de fluorescência EBI, localize as células que expressam proteínas fluorescentes ou sonda. Use a câmera digital para ajustar a iluminação da amostra fluorescente para visualizar as células selecionadas e ajustar o foco e ampliar para uma única célula.
Em seguida, use as funções Zoom e Definitive Focus para adquirir uma única série de lapso de tempo de pilha Z em uma frequência de um quadro a cada dois segundos para intervalos de tempo que variam entre 300 e 500 segundos. Salve e exporte as imagens de lapso de tempo como arquivos de pilha AVI ou TIFF. Para analisar as imagens de lapso de tempo, abra a sequência de imagem de lapso de tempo em ImageJ ou Fiji e use a ferramenta Split Channel para dividir os canais.
Na imagem do canal verde de oito bits, use a ferramenta Linha Segmentada para traçar uma linha ao longo das trajetórias das partículas usando a mesma convenção direcional desejada para todos os filmes para que a polaridade seja consistente dentro e em todas as células que estão sendo estudadas. Clique duas vezes na ferramenta Linha para ajustar a largura da linha para combinar com a espessura da faixa e executar a macro Draw Kymo do plugin Kymo ToolBox usando uma largura de linha de 10. Um prompt pedindo para calibrar a imagem no tempo e no espaço aparecerá.
Uma vez calibrados, os kymogramas serão gerados e podem ser salvos como arquivos TIFF. Para atribuir trajetórias de partículas, use a ferramenta Linha Segmentada para rastrear manualmente cada partícula no kymograph durante toda a duração da aquisição e usar o gerenciador de ROI para registrar cada trajetória de partícula como uma região de interesse. Salve todas as regiões de interesse por cada vídeo de lapso de tempo para análises adicionais e execute a macro Analyze Kymo do plugin Kymo ToolBox.
Uma janela se abrirá pedindo para definir a direção externa do movimento de partículas a partir do núcleo da célula de interesse do menu suspenso. A velocidade limite deve ser definida de acordo com a sensibilidade do software para cada carga de interesse e a largura da linha deve ser ajustada para corresponder à espessura de cada trajetória de partículas. O Log All Data and Log Extrapolated Coordinates deve ser para o cálculo dos vários parâmetros de transporte de carga.
Clique em Ok. Os dados calculados para as faixas individuais serão então agrupados por kymógrafo e salvos em arquivos de texto específicos para cada imagem. A combinação do tratamento arabinoside citosina com a estratégia de purificação baseada em agitação enriquece a pureza das culturas de astrócitos em relação aos protocolos tradicionais que incluem apenas o passo de purificação.
A transfecção baseada em lipofecção permite a expressão transitória de proteínas em níveis ideais para imagens de células vivas sem causar toxicidade ou afetar a viabilidade dos astrócitos. Da mesma forma, o uso de uma sonda fluorescente permite a rotulagem rápida e eficiente de organelas endolysomais ácidas para o rastreamento da dinâmica organela e astrócitos. Os dados de lapso de tempo da imagem podem ser usados para gerar kymogramas que rastreiam o movimento de carga no tempo e no espaço.
Nestes kymógrafos, o movimento anterograde da carga indicada é representado por trajetórias com encostas negativas, enquanto o movimento retrógrado é representado por trajetórias com encostas positivas. Vesículas estacionárias aparecem como trajetórias verticais. Nesta análise, a quantificação do fluxo de uma carga específica através de uma área do astrócito revelou diferenças no percentual de partículas modais entre cargas que são provavelmente representativas de sua motilidade de linha base normal na região do astrócito dentro do qual os filmes foram adquiridos.
O mapeamento preciso da mudança na posição X, Y ao longo da escala de tempo total para cada partícula obtida a partir do kymograph também pode ser usado para avaliar outros parâmetros de movimento, como velocidade de carga e comprimento de execução. Como este protocolo requer culturas de astrócitos de alta qualidade e rotulagem eficiente de carga, o tempo de incubação do reagente de transfecção e o cronograma de aquisição devem ser ajustados para cada plasmídeo ou carga de interesse. Este protocolo pode ser modificado para caracterizar eventos de transporte em astrócitos em resposta a danos celulares, toxicidade, mutações patogênicas, atividade sináptica ou alterações no ambiente intra ou extracelular.
