يمكن استخدام بروتوكولنا للتحقيق في حركية وتوطين العضيات الفلكية أو البروتينات تحت البيئات الخارجة عن الخلية والدول المرضية الخفيفة. على عكس الاستعدادات الثابتة MHA ، والتي توفر لقطات واحدة من توطين البروتين والعضية ، يمكن استخدام تقنية التصوير الحي لدينا لتحليل ديناميكيات الجسيمات في الخلايا الفلكية الحية الفردية. في اليوم السابق للبذور البذور transfection astrocytes في الكثافة المناسبة للتصوير في 24 إلى 48 ساعة بعد transfection.
تخفيف مُكشف الشفط في متوسطة مصل أقل إلى التركيز التجريبي المناسب. تمييع خمسة ميكروغرام من الحمض النووي عالية النقاء في 250 ميكرولترات من متوسطة المصل المخفضة وإضافة خمسة ميكرولترات من كاشف محسن الشفط إلى الأنبوب. اخلطي كاشف الشفط مع حجم متساو من مزيج محسن الشفط بالحمض النووي وحضن المحل لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
في نهاية الحضانة، وإزالة سوبرنانت من ثقافة الفلكية وإضافة 100 ميكرولترات من المزيج transfection قطرة إلى الخلايا. بعد ست ساعات في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون، استبدال مجمع transfection مع حجم مناسب من ثقافة الفلكية المتوسطة وإعادة الخلايا إلى حاضنة ثقافة الخلية لمدة 24 إلى 72 ساعة إضافية. قبل 30 دقيقة من التصوير ، تمييع مسبار وضع العلامات الليفية المناسبة في 200 ميكرولترات من ثقافة الخلايا الفلكية المتوسطة إلى تركيز عمل من ميكرومولار واحد وتسمية الخلايا الفلكية مع مسبار لمدة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية.
ثم غسل الخلايا مرة واحدة مع ثقافة astrocyte الدافئة المتوسطة واستبدال الغسيل مع المتوسطة التصوير. مباشرة بعد وضع العلامات التحقيق، ووضع حاوية ثقافة الفلكية في محول المناسبة على مرحلة المجهر واستخدام ضوء الفلورسينس EBI، وتحديد الخلايا التي تعبر عن البروتينات الفلورية أو التحقيق. استخدم الكاميرا الرقمية لضبط إضاءة عينة الفلورسنت لتصور الخلايا المحددة وضبط التركيز والتكبير إلى خلية واحدة.
ثم استخدم وظائف التكبير والتركيز المحدد للحصول على سلسلة زمنية تباعد Z-مكدس مفردة في تردد إطار واحد كل ثانيتين لفواصل زمنية تتراوح بين 300 و 500 ثانية. حفظ وتصدير الصور الفاصل الزمني كملفات مكدس AVI أو TIFF. لتحليل صور الفاصل الزمني، افتح تسلسل صورة الفاصل الزمني في ImageJ أو فيجي واستخدم أداة تقسيم القنوات لتقسيم القنوات.
في صورة القناة الخضراء الثمانية بت، استخدم أداة الخط المجزأ لتتبع خط على طول مسارات الجسيمات باستخدام نفس الاتفاقية الاتجاهية المطلوبة لجميع الأفلام بحيث تكون القطبية متسقة داخل وعبر جميع الخلايا التي تجري دراستها. انقر نقرا مزدوجا فوق أداة الخط لضبط عرض الخط لتتناسب مع سمك المسار وتشغيل الماكرو رسم Kymo من البرنامج المساعد Kymo ToolBox باستخدام عرض خط من 10. ستظهر مطالبة تطالب بمعايرة الصورة في الزمان والمكان.
بمجرد معايرتها، سيتم إنشاء كيموغرافات ويمكن حفظها كملفات TIFF. لتعيين مسارات الجسيمات، استخدم أداة الخط المجزأ لتتبع كل جسيم يدويًا في الكيموغراف طوال المدة الكاملة للاستحواذ واستخدام مدير عائد الاستثمار لتسجيل كل مسار جسيم كمنطقة ذات أهمية. حفظ جميع المناطق ذات الاهتمام لكل فيديو الفاصل الزمني لمزيد من التحليل وتشغيل ماكرو تحليل Kymo من البرنامج المساعد Kymo ToolBox.
سيتم فتح نافذة تطلب تحديد الاتجاه الخارجي للحركة الجسيمات من نواة الخلية من الفائدة من القائمة المنسدلة. وينبغي تحديد سرعة الحد وفقا لحساسية البرنامج لكل شحنة ذات فائدة، وينبغي تعديل عرض الخط لتتناسب مع سمك كل مسار الجسيمات. وينبغي أن يكون سجل جميع البيانات والإحداثيات المستقرة للسجل لحساب مختلف بارامترات نقل البضائع.
انقر فوق "حسناً". ثم يتم تجميع البيانات المحسوبة للمسارات الفردية لكل kymograph وحفظها في ملفات نصية خاصة بكل صورة. الجمع بين العلاج السيتوسين أرابينزيد مع استراتيجية تنقية على أساس اهتزاز يثري نقاء الثقافات الفلكية على البروتوكولات التقليدية التي تشمل خطوة تنقية فقط.
يسمح التربيص الدهني القائم على التعبير العابر للبروتينات عند المستويات المثلى للتصوير بالخلايا الحية دون التسبب في السمية أو التأثير على قابلية الحياة للبروتينات الفلكية. وبالمثل، فإن استخدام مسبار الفلورسنت يسمح بالوسم السريع والفعال للعضيات الحمضية العضية الحامضة لتتبع ديناميات العضية والمركبات الفلكية. يمكن استخدام بيانات الفاصل الزمني من التصوير لإنشاء kymographs التي تتبع حركة البضائع في الزمان والمكان.
في هذه الغرافيم، يتم تمثيل حركة البضائع المشار إليها بمسارات ذات منحدرات سالبة، بينما يتم تمثيل الحركة الرجعية بمسارات ذات منحدرات إيجابية. تظهر الـ"هاتينك" على أنها مسارات عمودية. في هذا التحليل، كشف القياس الكمي لتدفق شحنة معينة عبر منطقة من البضائع الفلكية عن اختلافات في النسبة المئوية للجسيمات الناصحة بين البضائع التي من المرجح أن تمثل حركة خط الأساس العادي في منطقة الفلكيات التي تم الحصول عليها من الأفلام.
ويمكن أيضاً أن يستخدم رسم الخرائط الدقيقة للتغير في وضع X، Y على طول المقياس الزمني الكامل لكل جسيم يتم الحصول عليه من الميكوغراف، لتقييم معلمات الحركة الأخرى، مثل سرعة الشحن وطول المدى. وبما أن هذا البروتوكول يتطلب ثقافات استروcyست عالية الجودة وسمات فعالة للشحن، ينبغي تعديل وقت الحضانة وإعادة بناء الحمل عبر الجسم والجدول الزمني للاكتساب لكل بلازميد أو حمولة ذات فائدة. يمكن تعديل هذا البروتوكول لتوصيف أحداث النقل في الخلايا الفلكية استجابة لتلف الخلايا، أو السمية، أو الطفرات المسببة للأمراض، أو النشاط المتشابك، أو التغيرات في البيئة داخل الخلية أو خارج الخلية.
