תאי SBNET מובחנים היטב גדלים לאט וקשה להפיץ אותם. קווי התאים המעטים שהוקמו אינם זמינים לחוקרים. כדי להתגבר על מגבלות אלה, פיתחנו פרוטוקול תרבות תלת-מימדי זה.
היתרון של טכניקה זו על השיטה המסורתית של הקמת קו תא SBNET הוא כי תרבויות 3D ניתן להשיג בדיקות סמים ניתן לעשות בתוך שלושה שבועות. שיטה זו יכולה להיות מיושמת על גידולים נוירואנדוקריניים אחרים כגון גידולים נוירואנדוקריניים מהלבלב. לאחר קבלת דגימת SBNET חולה חתוכה, לחתוך אותו לקוביות חמישה מילימטר ולאחסן אותו 25 מיליליטר של אמצעי DMEM F12 בצינור חרוט להובלה.
דגירה הגידולים במדיום לשטוף מוכן על פי הוראות כתב יד במשך 15 דקות. לאחר מכן מעבירים אותם לצלחת חדשה וטחון אותם לחתיכות פחות ממילימטר אחד באמצעות מספריים מעוקל סטרילי. מעבירים את הרקמות הטחון לצינור חדש של 50 מיליליטר המכיל 25 מיליליטר של מדיום שטיפה, ואז צנטריפוגה הדגימה ב 500 פעמים g במשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס.
השליכו את העל-טבעי והשקיעו מחדש את הכדורים ב-10 מיליליטר של מדיום שטיפה עם קולגנס ו-DNase. אפשר לגידולים הטחון לעכל ב 37 מעלות צלזיוס עם רעידות איטיות במשך 90 דקות. חשוב לא לעכל יתר על כן את דגימות הגידול.
יותר מדי אנזים או זמן דגירה ארוך יותר יהרוג תאי SBNET. לאחר סיום העיכול, צנטריפוגה הצינור ב 500 פעמים גרם במשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס. השליכו את העל-טבעי והשקיעו מחדש את גלולת הכדור ב-15 מיליליטר של מדיום שטיפה.
מניחים מסננת תא 70 מיקרומטר על גבי צינור חדש 50 מיליליטר ולהעביר 10 מיליליטר של חיץ לשטוף דרך מסננת. מערבל את חיץ הכביסה בתוך הצינור כדי למנוע מהתאים להידבק לצדדים. ואז לסנן את ההשעיה התא דרך מסננת.
צנטריפוגה התאים ב 500 פעמים גרם במשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס. השליכו את העל-טבעי והשקיעו מחדש את גלולת הכדור ב-200 מיקרוליטרים של מדיום שטיפה. מניחים את הצינור על קרח ולהשתמש חמישה microliters של התאים לספירת תאים עם המוציטומטר.
לחשב את מספר התאים, ולאחר מכן לחזור על הצנטריפוגה כדי להסיר את supernatant ולתלות מחדש את התאים ב- ECM נוזלי בריכוז של מיליון תאים למיליליטר. לאחר מכן, להעביר חמישה עד 20 microliters של spheroids SBNET ב ECM לצלחת 96 גם ולמקם את הצלחת באינקובטור 37 מעלות צלזיוס כדי לאפשר את ECM נוזלי להתגבש. הוסף 200 מיקרוליטרים של מדיום תרבות SBNET לכל באר המכילה כדוריות או תרבות האורגנואידים במדיה של תאי גזע כפי שתואר קודם לכן.
השתמש P1000 פיפטה להעביר את האורגנואידים לצינור 1.5 מיליליטר צנטריפוגה הצינור ב 1, 500 פעמים גרם לדקה אחת כדי להסיר את העל טבעי. לשטוף את התרבות עם מיליליטר אחד של PBS וצנטריפוגה שוב כדי להסיר את supernatant. לאחר מכן לתקן את האורגנואידים על ידי הוספת 500 microliters של paraformaldehyde ודגירה אותם במשך 15 דקות.
לאחר הדגירה, לשטוף את התרבות פעמיים עם מיליליטר אחד של PBS. הוסף 500 מיקרוליטרים של PBS עם 3%BSA ו-0.1% טריטון X-100 כדי לחלחל לתרבות. דגירה הצינור במשך חמש דקות, ולאחר מכן לשטוף את האורגנואידים שלוש פעמים עם מיליליטר אחד של PBS ו 3% BSA.
לאחר מכן, הדגירה את התרבות עם נוגדנים ראשוניים במשך שעה אחת ואז לחזור על לשטוף עם PBS ו BSA. דגירה עם הנוגדנים המשניים ולחזור על לשטוף הקפדה שאף ולהשליך את כל על טבעי. כדי לדמיין את הכדורים, הוסיפו חמישה מיקרוליטרים של מדיום הרכבה המכיל DAPI ולהשתמש בפיגט P20 כדי להעביר חמישה מיקרוליטרים של הכדורואידים לשקופית זכוכית.
לאטום את השקופית עם כיסוי ותמונה עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי באמצעות המטרות 10, 20 ו 40X. באופן מכני לשבור את ECM עם פיפטה P1000 ולהעביר אותו צינור סטרילי 1.5 מיליליטר. צנטריפוגה הצינור ב 1, 000 פעמים g בארבע מעלות צלזיוס.
ואז להסיר את כל supernatant ולה מניחים את הצינור על קרח. הוסף פעמיים עד ארבע פעמים את הנפח של ECM חדש גלולה ומערבבים את התוכן של הצינור על ידי צינור למעלה ולמטה 10 פעמים הקפדה להימנע החדרת בועות אוויר. העבר חמישה עד 20 מיקרוליטרים של תערובת ECM ו- SBNET לצלחת באר חדשה של 96 ומאפשרים ל- ECM להתגבש.
לאחר מכן לכסות את ECM מוצק עם מדיום SBNET חדש ולשים את הצלחת באינקובטור. אם משלוח SBNET spheroids למעבדה אחרת, להעביר את הכדורידים עם ECM החדש לבקבוק T25 ולאפשר ECM להתגבש. ממלאים את הבקבוק במדיום כדורי SBNET, דופקים היטב את המכסה ומכינים את חבילת המשלוח.
עם קבלת התרבות הכדורית, הסר את מדיום התרבות וחזור על הצעדים הקודמים כדי להחזיר את הכדורים לתרבות. קצב הצמיחה הכדורי SBNET היה במעקב עם הדמיה מיקרוסקופית. זה לוקח בערך 14 ימים עבור spheroids SBNET להכפיל את גודל כאשר התקשורת התרבותית משתנה פעם בשבוע.
לאחר 14 ימים בתרבות, כדורי SBNET אינם גדלים. הכדורואידים היו מוכתמים בנוגדנים ספציפיים נגד סינפטופיצין, כרומוגרנין A ו- SSTR2 ודימוי באמצעות מיקרוסקופיה immunofluorescence. הנתונים הראו כי סמנים אלה הם מקומיים בציטופלסמה וב קרום של תאי SBNET.
כדי להבטיח את הספציפיות של הנוגדנים, אותם הליכי הכתמה בוצעו על קו אורגנואידים מגידול בלבלב שאינו מבטא סינפטופיצין, כרומוגרנין A ו- SSTR2 ולא זוהה אות ירוק. היתרון העיקרי של הדמיה immunofluorescence הוא שזה יכול להתבצע בתוך ארבע שעות ולתת מידע מכתים דומה כמו immunohistochemistry. Culturing SBNET כמו כדוריות היא טכניקה יקרת ערך לזיהוי תרופות שיכול לעכב את הצמיחה SBNET.
הספרואידים טופלו במעכבי ראפמיצין ו-mTOR. לאחר חמישה ימים, הכדוריד שטופל בראפאמיצין יצר מבנה דמוי ענבים והפך לאפופטוטי או נמק. בעת ניסיון הליך זה, חשוב להרטיב מראש את מסננת התא ואת צינור האיסוף עם מדיום לשטוף.
פעולה זו תמנע מתאי SBNET להידבק למאמץ התאים ולצינור הפלסטיק. עם פרוטוקול זה, מדענים וקלינאים יכולים להקים תרבויות spheroid SBNET מגידולים חצויים, לשתף אותם עם מעבדות אחרות, ולהשתמש בהם לבדיקת תרופות שאושרו על ידי ה-FDA.
