İyi diferansiye SBNET hücreleri yavaş büyür ve yayılması zordur. Birkaç kurulan hücre hatları araştırmacılar için hazır değildir. Bu sınırlamaları aşmak için bu 3D kültür protokolünü geliştirdik.
Bu tekniğin geleneksel SBNET hücre hattı oluşturma yöntemine göre avantajı, 3D kültürlerin elde edilebiliyor olması ve üç hafta içinde uyuşturucu testinin yapılabildiğidir. Bu yöntem pankreas nöroendokrin tümörler gibi diğer nöroendokrin tümörler için uygulanabilir. Rezeke edilmiş bir hasta SBNET numunesi aldıktan sonra, beş milimetre küp ler halinde kesin ve 25 mililitre DMEM F12 ortamı içinde taşıma için konik bir tüpte saklayın.
El yazması talimatlara göre hazırlanan yıkama ortamında tümörleri 15 dakika kuluçkaya yatırın. Sonra yeni bir çanak aktarın ve steril kavisli makas kullanarak bir milimetreden daha az parçalar alavurun. Kıymalı dokuları 25 mililitre yıkama ortamı içeren yeni bir 50 mililitrelik tüpe aktarın, ardından numuneyi 500 kez g'de 15 dakika 4 santigrat derecede santrifüj edin.
Supernatant atın ve kollajenaz ve DNase ile yıkama orta 10 mililitre pelet resuspend. 90 dakika boyunca yavaş sallayarak kıyma tümörleri 37 santigrat derecede sindirimi için izin verin. Tümör örneklerini fazla sindirmemek önemlidir.
Çok fazla enzim veya daha uzun kuluçka süresi SBNET hücrelerini öldürür. Sindirim tamamlandıktan sonra, 4 santigrat derece 15 dakika boyunca 500 kez g tüp santrifüj. Supernatant atın ve yıkama orta 15 mililitre pelet resuspend.
Yeni bir 50 mililitrelik tüpün üzerine 70 mikrometrelik bir hücre süzgeci yerleştirin ve 10 mililitre yıkama tamponunu süzgeçten geçirin. Hücrelerin yanlara yapışmasını önlemek için tüpün içindeki yıkama tamponu girdap. Daha sonra süzgeç aracılığıyla hücre süspansiyon filtre.
Hücreleri 500 kez g'de 15 dakika 4 santigrat derecede santrifüj edin. Supernatant atın ve yıkama orta 200 mikrolitre pelet resuspend. Tüpü buza yerleştirin ve hemositometre ile hücre sayma için hücrelerin beş mikrolitrekullanın.
Hücre sayısını hesaplayın, sonra süpernatant kaldırmak ve mililitre başına bir milyon hücre konsantrasyonu sıvı ECM hücreleri yeniden askıya santrifüj tekrarlayın. Daha sonra, ECM'deki 5 ila 20 mikrolitre SBNET küresellitresini 96 kuyu plakasına aktarın ve sıvı ECM'nin katılaşabilmesi için plakayı 37 derece lik antiktürde bir kuluçka makinesine yerleştirin. Daha önce açıklandığı gibi kök hücre medyasında organoidler spheroids veya kültür içeren her kuyuya SBNET kültür ortamı 200 mikrolitre ekleyin.
Bir P1000 pipet bir 1.5 mililitre tüp organoidler aktarmak ve supernatant kaldırmak için bir dakika için 1, 500 kez g tüp santrifüj kullanın. Supernatant kaldırmak için tekrar PBS ve santrifüj bir mililitre ile kültür yıkayın. Daha sonra 500 mikrolitre paraformaldehit ekleyerek ve 15 dakika kuluçkaya yatarak organoidleri düzeltin.
Kuluçkadan sonra, kültürü bir mililitre PBS ile iki kez yıkayın. Kültürü permeabilize etmek için %3 BSA ve %0,1 Triton X-100 ile 500 mikrolitre PBS ekleyin. Tüpü beş dakika kuluçkaya yatırın, sonra organoidleri bir mililitre PBS ve %3 BSA ile üç kez yıkayın.
Daha sonra, bir saat boyunca birincil antikorlar ile kültür kuluçka sonra PBS ve BSA ile yıkıntıtekrar. Sekonder antikorlarla kuluçkaya yatın ve tüm supernatant'ı aspire edip atmayı unutmayın. Küresel leri görüntülemek için, DAPI içeren beş mikrolitre montaj ortamı ekleyin ve beş mikrolitre küresel mikrolitreyi cam bir slayta aktarmak için P20 pipetkullanın.
10, 20 ve 40X hedeflerini kullanarak slaytı bir kapak ve görüntü yle floresan mikroskopla kapatın. Mekanik bir P1000 pipet ile ECM kırmak ve steril bir 1.5 mililitretüp aktarın. Tüpü 1,000 kez 4 santigrat derecede santrifüj edin.
Sonra tüm supernatant çıkarın ve buz üzerinde tüp yerleştirin. Peletyeni ECM hacminin 2-4 katını ekleyin ve hava kabarcıklarının ortaya çıkmaması için 10 kez yukarı ve aşağı boru lar oluşturarak tüpün içeriğini karıştırın. ECM ve SBNET karışımının 5 ila 20 mikrolitresini yeni bir 96 kuyu plakasına aktarın ve ECM'nin katılaşmasını bekleyin.
Daha sonra katılaşmış ECM'yi yeni SBNET ortamıyla kaplayın ve plakayı kuvöze koyun. SBNET küreselleri başka bir laboratuvara gönderiyorsanız, yeni ECM'li küresel leri Bir T25 şişesine aktarın ve ECM'nin katılaşmasını bekleyin. Şişeyi SBNET küresel orta ile doldurun, kapağı sıkıca vidalayın ve sevkiyat paketini hazırlayın.
Küresel kültürü aldıktan sonra, kültür ortamını kaldırın ve küreselleri kültüre geri koymak için önceki adımları tekrarlayın. Mikroskobik görüntüleme ile SBNET küresel büyüme hızı izlendi. SBNET küresellerinin kültür ortamı haftada bir kez değiştiğinde iki katına çıkarmaları yaklaşık 14 gün sürer.
Kültürde 14 gün sonra, SBNET spheroids boyutu artmaz. Sferoidler sinaptophysin, kromogranin A ve SSTR2'ye özgü antikorlarla boyandı ve immünoforesan mikroskopi ile görüntülendi. Veriler bu belirteçlerin sitoplazmada ve SBNET hücrelerinin zarında lokalize olduğunu göstermiştir.
Antikorların özgüllüğünü sağlamak için, sinaptofirin, kromogranin A ve SSTR2'yi ifade etmeyen pankreas tümöründen organoid bir çizgi üzerinde aynı boyama işlemleri yapıldı ve yeşil sinyal saptanmadı. İmmünofloresan görüntülemenin en büyük avantajı dört saat içinde yapAbilmekte ve immünohistokimyagibi benzer boyama bilgileri verebilmektir. SBNET'in küresel olarak kültüre edilmesi, SBNET büyümesini engelleyen ilaçların tanımlanması nda kullanılan değerli bir tekniktir.
Spheroidler rapamisin ve mTOR inhibitörü ile tedavi edildi. Beş gün sonra, rapamisin tedavi küresel bir üzüm benzeri bir yapı kurdu ve apoptotik veya nekrotik oldu. Bu prosedürü denerken, hücre süzgeci ve toplama tüpünü yıkama ortamı ile önceden ıslamak önemlidir.
Bu, SBNET hücrelerinin hücre süzgecine ve plastik tüpe yapışmasını önler. Bu protokol ile bilim adamları ve klinisyenler rezeke tümörlerden SBNET küresel kültürleri kurabilir, diğer laboratuvarlarla paylaşabilir ve FDA onaylı ilaçları test etmek için kullanabilirler.
