Les cellules SBNET bien différenciées sont à croissance lente et difficiles à propager. Les quelques lignées cellulaires établies ne sont pas facilement accessibles aux chercheurs. Pour surmonter ces limites, nous avons développé ce protocole de culture 3D.
L’avantage de cette technique par rapport à la méthode traditionnelle d’établissement d’une lignée cellulaire SBNET est que les cultures 3D peuvent être obtenues et le dépistage des drogues peut être fait dans les trois semaines. Cette méthode peut être appliquée à d’autres tumeurs neuroendocrines telles que les tumeurs neuroendocrines du pancréas. Après avoir obtenu un échantillon de SBNET du patient réséqué, coupez-le en cubes de cinq millimètres et rangez-le en 25 millilitres de milieu DMEM F12 dans un tube conique pour le transport.
Incuber les tumeurs dans le milieu de lavage préparé selon les instructions manuscrites pendant 15 minutes. Ensuite, transférez-les dans un nouveau plat et hachez-les en morceaux de moins d’un millimètre à l’aide de ciseaux incurvés stériles. Transférer les tissus hachés dans un nouveau tube de 50 millilitres contenant 25 millilitres de milieu de lavage, puis centrifuger l’échantillon à 500 fois g pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius.
Jeter le supernatant et resuspendre les granulés dans 10 millilitres de milieu de lavage avec collagène et DNase. Laissez les tumeurs hachées digérer à 37 degrés Celsius avec des secousses lentes pendant 90 minutes. Il est important de ne pas trop digérer les échantillons tumoraux.
Trop d’enzymes ou un temps d’incubation plus long tueront les cellules SBNET. Une fois la digestion terminée, centrifuger le tube à 500 fois g pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius. Jetez le supernatant et resuspendez la pastille en 15 millilitres de lavauge moyenne.
Placez une passoire à cellules de 70 micromètres sur un nouveau tube de 50 millilitres et transférez 10 millilitres du tampon de lavage à travers la passoire. Faites tourbillonner le tampon de lavage à l’intérieur du tube pour empêcher les cellules de coller sur les côtés. Filtrez ensuite la suspension cellulaire à travers la passoire.
Centrifuger les cellules à 500 fois g pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius. Jeter le supernatant et réutiliser la pastille dans 200 microlitres de lavauge moyenne. Placez le tube sur la glace et utilisez cinq microlitres des cellules pour le comptage cellulaire à l’aide d’un hémocytomètre.
Calculer le nombre de cellules, puis répéter la centrifugation pour enlever le supernatant et resuspendre les cellules dans l’ECM liquide à une concentration d’un million de cellules par millilitre. Ensuite, transférez de cinq à 20 microlitres de sphéroïdes SBNET dans ecm à une plaque de puits de 96 et placez la plaque dans un incubateur de 37 degrés Celsius pour permettre à l’ECM liquide de se solidifier. Ajouter 200 microlitres de milieu de culture SBNET à chaque puits contenant des sphéroïdes ou de la culture des organoïdes dans les médias de cellules souches comme décrit précédemment.
Utilisez une pipette P1000 pour transférer les organoïdes dans un tube de 1,5 millilitre et centrifugez le tube à 1 500 fois g pendant une minute pour enlever le surnatant. Laver la culture avec un millilitre de PBS et centrifugeuse à nouveau pour enlever le supernatant. Puis fixer les organoïdes en ajoutant 500 microlitres de paraformaldéhyde et en les incubant pendant 15 minutes.
Après l’incubation, laver la culture deux fois avec un millilitre de PBS. Ajouter 500 microlitres de PBS avec 3%BSA et 0,1%Triton X-100 pour perméabiliser la culture. Incuber le tube pendant cinq minutes, puis laver les organoïdes trois fois avec un millilitre de PBS et 3%BSA.
Ensuite, incuber la culture avec des anticorps primaires pendant une heure, puis répéter les lavages avec PBS et BSA. Incuber avec les anticorps secondaires et répéter les lavages en s’assurant d’aspirer et de jeter tous les supernatants. Pour imager les sphéroïdes, ajoutez cinq microlitres de support de montage contenant du DAPI et utilisez une pipette P20 pour transférer cinq microlitres des sphéroïdes à une toboggan en verre.
Scellez la diapositive avec un coverslip et une image avec un microscope à fluorescence à l’aide des objectifs 10, 20 et 40X. Casser mécaniquement l’ECM avec une pipette P1000 et la transférer dans un tube stérile de 1,5 millilitre. Centrifugeuse le tube à 1000 fois g à quatre degrés Celsius.
Retirez ensuite tout supernatant et placez le tube sur la glace. Ajouter deux à quatre fois le volume de nouveaux ECM à la pastille et mélanger le contenu du tube en pipetage de haut en bas 10 fois en s’assurant d’éviter d’introduire des bulles d’air. Transférer de cinq à 20 microlitres du mélange ECM et SBNET dans une nouvelle plaque de puits 96 et permettre à l’ECM de se solidifier.
Couvrez ensuite l’ECM solidifié avec le nouveau support SBNET et mettez la plaque dans l’incubateur. Si vous expédiez des sphéroïdes SBNET dans un autre laboratoire, transférez les sphéroïdes avec le nouvel ECM dans un flacon T25 et permettez à l’ECM de se solidifier. Remplissez le flacon avec le milieu sphéroïde SBNET, vissez le bouchon bien et préparez l’emballage d’expédition.
En recevant la culture sphéroïde, retirez le milieu de culture et répétez les étapes précédentes pour remettre les sphéroïdes en culture. Le taux de croissance sphéroïde de SBNET a été surveillé avec la formation image microscopique. Il faut environ 14 jours pour que les sphéroïdes SBNET doublent de taille lorsque le média culturel est changé une fois par semaine.
Après 14 jours de culture, les sphéroïdes SBNET n’augmentent pas en taille. Les sphéroïdes ont été tachés avec des anticorps spécifiques contre la synaptophysine, la chromogranine A et le SSTR2 et photographiés à l’aide de microscopie d’immunofluorescence. Les données ont montré que ces marqueurs sont localisés dans le cytoplasme et à la membrane des cellules SBNET.
Pour assurer la spécificité des anticorps, les mêmes procédures de coloration ont été exécutées sur une ligne organoïde d’une tumeur de pancréas qui n’exprime pas la synaptophysine, la chromogranine A et le SSTR2 et aucun signal vert n’a été détecté. Le principal avantage de la formation image d’immunofluorescence est qu’elle peut être exécutée dans un délai de quatre heures et donner l’information semblable de coloration que l’immunohistochimie. La culture du SBNET comme sphéroïdes est une technique précieuse pour identifier les médicaments qui peuvent inhiber la croissance du SBNET.
Les sphéroïdes ont été traités avec la rapamycine et l’inhibiteur de mTOR. Après cinq jours, le sphéroïde traité à la rapamycine a formé une structure en forme de raisin et est devenu apoptotique ou nécrotique. Lorsque vous essayez cette procédure, il est important de pré-mouiller la passoire cellulaire et tube de collecte avec milieu de lavage.
Cela empêchera les cellules SBNET de coller à la passoire cellulaire et au tube en plastique. Avec ce protocole, les scientifiques et les cliniciens peuvent établir des cultures sphéroïdes SBNET à partir de tumeurs réséquées, les partager avec d’autres laboratoires, et les utiliser pour tester les médicaments approuvés par la FDA.
