Хорошо дифференцированные клетки SBNET медленно растут и трудно размножаются. Несколько установленных клеточных линий не всегда доступны исследователям. Чтобы преодолеть эти ограничения, мы разработали этот 3D-протокол культуры.
Преимущество этого метода по сравнению с традиционным методом создания линии клеток SBNET заключается в том, что 3D культуры могут быть получены и тестирование на наркотики может быть сделано в течение трех недель. Этот метод может быть применен к другим нейроэндокринных опухолей, таких как нейроэндокринные опухоли из поджелудочной железы. После получения повторного пациента SBNET образца, разрезать его на пять миллиметров кубов и хранить его в 25 миллилитров DMEM F12 среды в конической трубе для транспортировки.
Инкубировать опухоли в стиральной среде подготовлены в соответствии с рукописными указаниями в течение 15 минут. Затем перенесите их в новое блюдо и измельчите их до менее чем одного миллиметра штук с помощью стерильных изогнутых ножниц. Перенесите рубленые ткани в новую 50-миллилитровую трубку, содержащую 25 миллилитров среды для мытья, затем центрифугу образца при 500 г в течение 15 минут при четырех градусах Цельсия.
Откажитесь от супернатанта и повторно посовестите гранулы в 10 миллилитров стиральной среды с коллагеназой и DNase. Разрешить рубленые опухоли, чтобы переварить при 37 градусов по Цельсию с медленной тряски в течение 90 минут. Важно не переваривать образцы опухоли.
Слишком много ферментов или больше времени инкубации убьет клетки SBNET. После того, как пищеварение завершено, центрифуга трубки при 500 раз g в течение 15 минут при четырех градусах Цельсия. Откажитесь от супернатанта и повторно посовелите гранулы в 15 миллилитров средства для мытья.
Поместите 70-метровый клеточный ситечко поверх новой 50-миллилитровой трубки и перенесите 10 миллилитров буфера стирки через ситечко. Закружить буфер мытья внутри трубки, чтобы предотвратить клетки от прилипания к бокам. Затем фильтруй подвеску клетки через ситечко.
Центрифуга клетки при 500 раз g в течение 15 минут при четырех градусах Цельсия. Откажитесь от супернатанта и повторно посовелите гранулы в 200 микролитров стиральной среды. Поместите трубку на лед и используйте пять микролитров клеток для подсчета клеток с гемоцитометром.
Рассчитайте количество клеток, затем повторите центрифугу, чтобы удалить супернатант и повторно использовать клетки в жидком ЭКМ при концентрации одного миллиона клеток на миллилитр. Затем перенесите от пяти до 20 микролитров сфероидов SBNET в ECM на пластину 96 и поместите пластину в инкубатор 37 градусов по Цельсию, чтобы позволить жидкому ЭКМ затвердеть. Добавьте 200 микролитров среды культуры SBNET к каждому хорошо содержащем сфероиды или культуру органоидов в стволовых клетках, как описано ранее.
Используйте P1000 пипетку для передачи органоидов в 1,5 миллилитровую трубку и центрифугу трубки при 1500 раз г в течение одной минуты, чтобы удалить супернатант. Вымойте культуру с одним миллилитров PBS и центрифуги снова удалить супернатант. Затем исправить органоиды, добавив 500 микролитров параформальдегида и инкубации их в течение 15 минут.
После инкубации, мыть культуру в два раза с одним миллилитров PBS. Добавьте 500 микролитров PBS с 3%BSA и 0.1%Triton X-100, чтобы пронизать культуру. Инкубировать трубку в течение пяти минут, затем мыть органоиды три раза с одним миллилитром PBS и 3%BSA.
Далее, инкубировать культуру с первичными антителами в течение одного часа, а затем повторить моет с PBS и BSA. Инкубировать со вторичными антителами и повторить моет убедившись, чтобы аспирировать и отказаться от всех супернатантов. Для изображения сфероидов добавьте пять микролитров монтажной среды, содержащей DAPI, и используйте пипетку P20 для переноса пяти микролитров сфероидов на стеклянную горку.
Печать слайда с крышкой и изображение с флуоресцентный микроскоп с использованием 10, 20 и 40X целей. Механически разорвать ECM с P1000 пипетки и передать его в стерильной 1,5 миллилитровой трубки. Центрифуга трубки при 1000 раз г при четырех градусах Цельсия.
Затем удалите все супернатанты и поместите трубку на лед. Добавьте в гранулы в два-четыре раза больше нового ECM и смешайте содержимое трубки, трубя вверх и вниз в 10 раз, чтобы избежать введения пузырьков воздуха. Перенесите от пяти до 20 микролитров смеси ECM и SBNET на новую пластину 96 и позвольте ECM укрепиться.
Затем накройте затвердевую ECM новой средой SBNET и положите пластину в инкубатор. При доставке сфероидов SBNET в другую лабораторию, перенесите сфероиды с новым ECM в колбу T25 и позвольте ECM укрепиться. Заполните колбу сфероидной средой SBNET, плотно привинчивай крышку и подготовь пакет груза.
Получив сфероидную культуру, удалите культурную среду и повторите предыдущие шаги, чтобы вернуть сфероиды в культуру. Скорость роста сфероидов SBNET отслеживалась с помощью микроскопической визуализации. Это займет около 14 дней для SBNET сфероидов удвоить размер, когда культура средств массовой информации меняется один раз в неделю.
После 14 дней в культуре, SBNET сфероиды не увеличиваются в размерах. Сфероиды были окрашены антителами, специфическими против синаптофизина, хромогранина А и SSTR2, и изображения с использованием микроскопии иммунофлуоресценции. Данные показали, что эти маркеры локализованы в цитоплазме и на мембране клеток SBNET.
Для обеспечения специфичности антител, те же процедуры окрашивания были выполнены на органоидной линии из опухоли поджелудочной железы, которая не выражает синаптофизин, хромогранин A и SSTR2 и не был обнаружен зеленый сигнал. Основным преимуществом иммунофлуоресценции изображения является то, что она может быть выполнена в течение четырех часов и дать аналогичную информацию окрашивания, как иммуногистохимия. Культивирование SBNET как сфероидов является ценным методом для выявления препаратов, которые могут препятствовать росту SBNET.
Сфероиды лечились рапамицином и ингибитором mTOR. Через пять дней обработанный рапамицином сфероид сформировал виноградную структуру и стал апоптотической или некротической. При попытке этой процедуры, важно предварительно мокрый клеточный ситечко и сбора трубки со средой мытья.
Это предотвратит SBNET клетки от вставлять к ситечко клетки и пластичной пробке. С помощью этого протокола, ученые и клиницисты могут установить SBNET сфероидных культур из ресектируемых опухолей, поделиться ими с другими лабораториями, и использовать их для тестирования FDA утвержденных препаратов.
