分化良好的SBNET细胞生长缓慢，难以繁殖。少数已建立的细胞系对研究人员不易获得。为了克服这些限制，我们开发了此 3D 培养协议。
与传统建立SBNET细胞系的方法相比，该技术的优点是可以获得3D培养，并在三周内完成药物测试。该方法可应用于其他神经内分泌肿瘤，如胰腺神经内分泌肿瘤。在获得经过切除的患者 SBNET 样本后，将其切成 5 毫米立方体，并将其存放在 25 毫升 DMEM F12 介质中，用于锥形管运输。
根据手稿说明在洗涤介质中孵育肿瘤15分钟。然后将它们转移到一个新的菜，用无菌弯曲的剪刀把它们切碎到不到一毫米的碎片。将切碎的组织转移到含有 25 毫升洗涤介质的新的 50 毫升管中，然后在 4 摄氏度下以 500 倍 g 离心样品，15 分钟。
丢弃上一杯，用胶原酶和DNase将颗粒重新用10毫升的洗涤介质中重新暂停。让切碎的肿瘤在37摄氏度下消化，缓慢摇晃90分钟。重要的是不要过度消化肿瘤样本。
太多的酶或更长的孵育时间会杀死SBNET细胞。消化完成后，在4摄氏度下以500倍g离心管15分钟。丢弃上一杯，将颗粒重新在 15 毫升的洗涤介质中。
将 70 微米细胞过滤器放在新的 50 毫升管上，并通过过滤器转移 10 毫升的洗涤缓冲液。旋转管内的洗涤缓冲液，防止细胞粘在两侧。然后通过过滤器过滤细胞悬浮液。
在4摄氏度下以500倍g离心细胞15分钟。丢弃上一杯，将颗粒重新在200微升洗涤介质中。将管子放在冰上，使用五微升细胞进行细胞计数，使用血细胞计。
计算细胞数量，然后重复离心，以去除上清液，然后以每毫升一百万个细胞的浓度重新暂停液体 ECM 中的细胞。接下来，将 ECM 中 5 到 20 微升的 SBNET 球体转移到 96 井板中，将板放在 37 摄氏度的培养箱中，使液体 ECM 凝固。如前文所述，将200微升的SBNET培养培养剂添加到每个含有球状物质或培养干细胞培养的井中。
使用 P1000 移液器将管体转移到 1.5 毫升管中，并在 1，500 次 g 下将管离心一分钟，以去除上流液。用一毫升 PBS 清洗培养物，然后再次离心以去除上一代。然后通过加入500微升的半甲醛并孵育15分钟来修复器官。
孵育后，用一毫升PBS洗涤培养。添加 500 微升 PBS 和 3%BSA 和 0.1% Triton X-100 以渗透培养。孵育管5分钟，然后用1毫升PBS和3%BSA洗三次管。
接下来，用原抗体孵育培养组一小时，然后用PBS和BSA重复洗涤。与二次抗体孵育并重复洗涤，确保吸气并丢弃所有上流剂。要对球体进行成像，请添加五个包含 DAPI 的安装介质微升，并使用 P20 移液器将球体的五微升转移到玻璃幻灯片中。
使用荧光显微镜使用 10、20 和 40 倍目标用盖玻片和图像密封幻灯片。使用 P1000 移液器机械地断开 ECM，然后将其转移到无菌的 1.5 毫升管中。在4摄氏度下将管子以1000倍g离心。
然后取出所有上一日，将管子放在冰上。将新 ECM 的体积增加 2 到 4 倍到颗粒，通过上下移液 10 次混合管内装物，确保避免冒气泡。将 ECM 和 SBNET 混合物的 5 到 20 微升转移到新的 96 井板中，使 ECM 凝固。
然后用新的 SBNET 介质盖住凝固的 ECM，将板放入培养箱中。如果将 SBNET 球体运送到另一个实验室，则将带新 ECM 的球体转移到 T25 烧瓶中，并允许 ECM 凝固。用 SBNET 球状介质填充烧瓶，拧紧盖子，并准备装运包装。
接收球体区域性后，删除区域性介质并重复前面的步骤，将球体放回区域性中。通过显微成像监测SBNET球体生长速率。当区域性介质每周更改一次时，SBNET 球体的大小需要大约 14 天才能翻倍。
在培养14天后，SBNET球体的大小不会增加。球体沾染了特异性对抗突触物理、色球蛋白 A 和 SSTR2 的抗体，并使用免疫荧光显微镜进行成像。数据表明，这些标记在细胞质和SBNET细胞膜中局部化。
为了确保抗体的特异性，在胰腺肿瘤的器官线上进行了相同的染色程序，该根体不表达突触物理、色罗酮A和SSTR2，并且未检测到绿色信号。免疫荧光成像的主要优点是，它可以在四小时内完成，并给出与免疫组织化学类似的染色信息。将SBNET培养为球体是识别可抑制SBNET生长的药物的宝贵技术。
球类用拉帕霉素和mTOR抑制剂治疗。五天后，拉帕霉素处理球体形成葡萄状结构，成为凋亡或坏死。尝试此程序时，必须用洗涤介质预湿细胞过滤器和收集管。
这将防止SBNET细胞粘附在细胞过滤器和塑料管上。通过该协议，科学家和临床医生可以从被切除的肿瘤中建立SBNET球状培养物，与其他实验室共享，并使用它们来测试FDA批准的药物。
