פרוטוקול זה משתמש בטכניקה נפוצה יחד עם רייגנטים וכלים שניתן לרכוש באופן מסחרי כדי להעריך הפעלת IRF5 אנדוגני במהלך האירועים המוקדמים של גירוי. זה יכול בקלות להיות מיושם על ביולוגיה IRF5 מבחן בהקשר תאי אחר. בעוד ש-PAGE מקורי הוא טכניקה נפוצה, השגת תוצאות ברורות, חזקות, ניתנות לפרשנות ושחזור יכולות להיות מאתגרות מבחינה טכנית.
שימוש במאגר ריצה מסחרי ובמערכת ג'ל מסייע למזער את השונות. ותשומת לב לפרטים היא חיונית, וניסיון הוא המפתח להצלחה בהשגת תוצאות טובות. פרוטוקול דף מקורי זה שהשתנה כרוך בשלבים רבים עם פרטים עדינים שהם המפתח להצלחה.
הדגמה חזותית יכולה להראות את הפרטים האלה זה יהיה מועיל לחוקרים. שמור על תרבות התאים CAL-1 בבקבוק T75 ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני, עם מדיום RPMI 1640 מלא. כאשר מוכנים לעורר את התאים, להעביר אותם צינור חרוט 50 מיליליטר צנטריפוגה אותם ב 200 x g במשך חמש דקות.
הסר את supernatant, ולהשעות מחדש את גלולה במדיום כדי לקבל השעיה הומוגנית תא יחיד. לאחר מכן חשבון התאים עם hemocytometer, ולזרע אותם בצפיפות של 1, 000, 000 תאים לגם בצלחת שש באר עם ארבעה מיליליטר של מדיום מחומם מראש בכל באר. דגירה התאים במשך 20 עד 24 שעות כדי לאפשר את הקונפדרציה להגיע 90 עד 95%למחרת, לעורר את התאים על ידי הוספת ארבעה microliters של מיליגרם אחד למיליליטר R848 ל הבאר, הקפדה להשאיר שליטה היטב עם תאים ולא טיפול R848.
בעדינות לנענע את הצלחת מצד לצד כדי לפזר באופן שווה את R848, ולאחר מכן דגירה התאים במשך 2 עד 16 שעות ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני. לאחר הדגירה, להעביר את המתלים התא מהצלחת לתוך צינורות צנטריפוגה 5 מיליליטר. צנטריפוגה התאים ב 200 x g במשך חמש דקות, ולאחר מכן להסיר את supernatant, ולהשעות מחדש את גלולה במיליליטר אחד של PBS.
העבר את ההשעיה התא לתוך צינור 1.5 מיליליטר, ולסובב אותו למטה ב 12, 000 x g במשך 30 עד 60 שניות ב 4 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן להסיר בזהירות את העל טבעי. מכינים את חיץ התיזה לפי הוראות כתב היד, ולשמור אותו על קרח עד מוכן לשימוש. להשעות מחדש את גלולת התא ב 30 מיקרוליטרים של חיץ תיזה קר כקרח, ו pipette למעלה ולמטה לערבב.
ואז להחגירה את הצינור על קרח במשך 15 עד 20 דקות. להבהיר את lysate על ידי צנטריפוגה ב 12, 000 x גרם במשך 15 עד 20 דקות ב 4 מעלות צלזיוס, ולהעביר את העל טבעי צינור 1.5 מיליליטר מקורר מראש, הקפדה לשמור את התמציות על קרח בכל עת. לאחר מכן, למדוד את ריכוז החלבון באמצעות ברדפורד Reagent.
הכינו את מאגרי האלקטרופורזה בתא העליון והתחתון בהתאם לכיווני כתב היד, ושטוף ג'ל PAGE מקורי 3-12% ביסודיות במים, מבלי לעוות את הבארות יש לנקוט טיפול נוסף בעת הטיפול בנתרן deoxycholate. PPE להגנה כגון חלוק מעבדה, משקפי בטיחות ומסכה נדרשים לטיפול בכימיקל. לאחר מכן, להגדיר את הג'ל לתוך מיכל ג'ל מיני, להסיר את המסרק, להוסיף את מאגרי אלקטרופורזה מוכן העליון והתחתון התא, ולהפעיל אותו מראש בחדר קר 4 מעלות צלזיוס או על קרח ב 150 וולט במשך 30 דקות.
בינתיים, הכינו את הדגימות לטעינה על ידי ערבוב החלבונים התאיים על הקרח עם חיץ מדגם מקורי פי 4. לאחר השלמת הריצה מראש, יש לטעון 10 עד 15 מיקרוגרם חלבון לכל באר, ולהפעיל את הג'ל במשך 30 דקות ב-85 וולט, ולאחר מכן שעתיים ב-150 וולט. לאחר מכן, להשרות את הג'ל SDS פועל חיץ במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
הפעל את קרום דיפלאוריד פוליווינילידן על ידי השרייתו במתנול במשך כחמש דקות. בצע חתך בפינה אחת של הממברנה כדי לציין את האוריינטציה שלה, ולהרכיב את כריך ההעברה על פי פרוטוקול היצרן. מניחים את קלטת ההעברה לתוך הטנק ומעבירים ב 20 וולט במשך שעה אחת על הקרח.
לאחר מכן להסיר את הממברנה מן הקלטת עם מ forceps פלסטיק ולחסום את הממברנה בחסימת חיץ בטמפרטורת החדר במשך 45 דקות על שייקר נדנדה. לאחר מכן, הדגירה את הממברנה עם הנוגדן העיקרי ב 4 מעלות צלזיוס לילה או בטמפרטורת החדר במשך שעתיים ולשטוף אותו עם חיץ כביסה 1XTBST במשך שלוש דקות תוך נדנדה. לאחר מכן הדגירה את הממברנה עם הנוגדן המשני שוב באמצעות חיץ כביסה 1XTBST בטמפרטורת החדר במשך 45 דקות, חוזר על לשטוף.
לאחר מכן סרוק את הכתם באמצעות מערכת תיעוד ג'ל מתאימה. באמצעות פרוטוקול זה, תאי CAL-1 שהיו מגורים או לא גירוי עם R848 נותחו עם immunoblot. בתאי CAL-1 לא מנומקים, IRF5 זוהה כרצועה בודדת בדף המקורי המתאימה לצורתו המונומרית.
עבור התאים מגורה, רמת מונומר IRF5 ירד, בעוד רמת העמעום גדל. אימונובלו עם נוגדן נגד IRF5 בוצע על IRF5 over-expressing 293 תאי T מומרים עם מבנים שונים. לא זוהה IRF5 בשליטה הלא פתורה, המדגימה את הספציפיות של הנוגדן נגד IRF5.
רצועה אחת המתאימה ל- IRF5 מונומרי זוהתה רק ב- IRF5 של 293 תאי T. כאשר מבנים קידוד IRF5 הפעלת חלבונים נותבו במשותף, רצועה נודדת לאט המתאים הצורה dimeric של IRF5 הופיע. עם זאת, NMDA5, חלבון הקשור RIG-I, לא לגרום עמעום IRF5.
השימוש בג'לים הדרגתיים של ביס-טריס הוא חיוני, ככל הנראה בשל ה- pH הספציפי וההרכב הכימי של מערכות אלקטרופורטיות ג'ל זה שאיפשרו הפרדה של צורות מונומריות ודימריות של IRF5. כמו כן, lysing ושמירה על lysates התא במאגר מדגם מקורי שאינו denaturing שומרת על מבני חלבון מקוריים. כאן השתמשנו באחד זמין מסחרית המותאמת לחומצות דף מקוריות.
שיטה נוספת שמחמיא מאוד עם זה היא, היא לנצל את מערכת cytometry זרימת הדמיה ImageStream כדי להעריך טרנסלוקציה גרעינית IRF5, שהוא החומר כי בהפעלת IRF5 לאחר עמעום. בשילוב עם הפרוטוקול שלנו, הוא משמש כסוג אחר של בדיקה כדי לאמת את השלבים המעורבים בהפעלת IRF5. בהיותו רגולטור מפתח של התגובה הדלקתית, IRF5 ממלא תפקיד חשוב בזיהום וחסינות, מחלות אוטואימוניות, סרטן ומחלות רבות אחרות החשובות לבריאות האדם.
ישנם גם מאמצים בפיתוח טיפולים למקד IRF5 וגורמי שעתוק הקשורים. פרוטוקול זה יאפשר לחוקרים בתחומים מגוונים להבין ולבדיקה ביולוגיה של IRF5.
