פרוטוקול זה הוא משמעותי, כי זו הפעם הראשונה כי נתונים transcriptomic יתושים Anopheles Gambiae נעשה בחופשיות ובקלות נגיש במקום אחד. טכניקה זו מאפשרת לכל החוקרים, גם אלה ללא רקע בביואינפורמטיקה לגשת בחופשיות ובקלות לנתונים על הגנים האהובים עליהם ועל יתושים עמידים בפני קוטלי חרקים. כדי להתחיל, הפעל את הקישור בתחתית דף הפרוייקט של LSTM IR-TEx כדי להפעיל את יישום האינטרנט IR-Tex בדפדפן אינטרנט.
לאחר אתחול דף האינטרנט, לחץ על לחצן יישום בחלק העליון של הדף, אשר יציג את היישום ואת הפלטים המשויכים. קרא כל פלט הקשור לערך ברירת המחדל בתיבה מזהה תעתיק. בחר תנאים וערכות נתונים Anopheles Coluzzii החשופות לקוטלי חרקים פירתרואידים, או לא נחשפות לכל מעמד קוטלי חרקים ותעתיקים הקשורים עם מקדם מתאם של יותר מ 0.98.
כדי לחקור ביטוי של תעתיק של עניין, בחר תחילה את התמליל. לאחר מכן, הזן את מזהה התמליל לתוך תיבת מזהה התמליל, לזכור כי התמלילים מסתיימים RX תלוי isoform של עניין. בחר את ערכות הנתונים שיש לחקור על-ידי לקיחת התיבות הרלוונטיות עבור מדינות, כולל מצב חשיפה, מינים בעלי עניין ומעמד של קוטלי חרקים.
ודא שקריטריונים אלה גורמים ליותר מערכות נתונים כלולות אחת. לחץ על עדכן תצוגה בתחתית תפריט הבחירה או הקש Return, תוך התעלמות מתאים מוחלטים לעת עתה. תן ליישום זמן לעדכן.
בין אם זה הגרף הראשון יש את Log2 לקפל שינוי בין אוכלוסייה עמידה, ומעבדה רגישים אוכלוסיית יתושים של התמליל של עניין, על פני כל ערכת נתונים העונה על הקריטריונים שנבחרו. קרא את המידע מתחת לגרף כאשר הקיפול משתנה בין היתושים העמידים והרגישים עבור כל ערכת נתונים רלוונטית, בנוסף לערכי P המותאמים המשויכים. כל שורה מייצגת בדיקות בודדות במערך המיקרו.
קרא את הטבלה הנוסף להלן, כמו מספר הניסויים שבהם התמליל של עניין הוא משמעותי, כמו גם את המספר הכולל של ניסויים התואמים את הקריטריונים שנבחרו. כדי להוריד את הנתונים בתבנית מופרדת באמצעות טאבים, לחץ על לחצן הורד מתחת לשתי הטבלאות. פעולה זו מאפשרת למשתמש לחקור נתונים בצורה קלה יותר, באמצעות תוכנית כגון Excel.
כל נקודה במפה מייצגת את אתרי האיסוף המשוערים של יתושים עמידים בכל ערכת נתונים, שבהם תמליל העניין בא לידי ביטוי באופן דיפרנציאלי. הצבעים עוקבים אחר מערכת רמזורים המוסברת באפליקציה. שמור את הפלטים הגרפיים על-ידי לחיצה באמצעות לחצן העכבר הימני, לחיצה על שמירת תמונה בשם ובחירת תיקיה מתאימה.
במקרה של שגיאת פלט על-ידי היישום, סביר להניח שאף ערכות נתונים לא תואמות לקריטריונים שהוינו. ניתן להשתמש במתאמים של תבניות הביטוי של תעתיקים על-פני ערכות נתונים מרובות כדי לחזות פונקציית תעתיק, ולהקל על תעתיקים מוסדרים במשותף מאותו מסלול. לפני לחיצה על עדכן תצוגה, הזז את מחוון ערך המתאם המוחלט ל- 0.85 ולחץ על עדכן תצוגה או הקש Return.
בדוק את טבלת המתאם כדי למצוא את התמלילים המרובים המוצגים כעת ומתואמים עם המוקלטים והתעתיק. קרא את הטבלה מתחת לפלט הגרפי, המכילה את ערך המתאם עבור כל תעתיק. כדי להוריד את הנתונים בתבנית מופרדת באמצעות טאבים, לחץ על לחצן הורד.
טפל במ המחוון של ערך המתאם המוחלט וצפה בשינויים בגרף ובטבלה התחתונים ביותר. מחרוזת נמוכה יותר של ערך המתאם תציג יותר תעתיקים, אך תציג יותר רעש. לאחר התקנת IR-TEx, פתח את קובץ הקידוד המשלים RStudio1 והפעל כל שורה כדי להגדיר את המערכת עבור IR-TEx.
לאחר שכל החבילות יותקנו ויעודכנו בהצלחה כנדרש, עבור אל קובץ, פתח. אתר IR_TEx. r, להדגיש ולפתוח.
זה צריך להיות גלוי כעת בחלון העליון של RStudio. כדי להפעיל את האפליקציה, לחץ על לחצן הפעל יישום בחלק השמאלי העליון של החלון. חלון שני יצץ שבו האפליקציה תיטען.
לאחר השלמת הטעינה, לקבלת פונקציונליות מלאה, לחץ על פתח בדפדפן, הממוקם בחלק השמאלי העליון של החלון שנטען. המשתמש יכול להוסיף ערכות נתוני התנגדות חדשות ל- IR-TEx שנוצרו באמצעות מערך Anopheles Gambiae 15k Agilent, כמתואר בפרוטוקול TEx. פתח קובץ נוסף2.txt.
קובץ מחפש RNA זה מייצג את התבנית שבה יש להתבסס על נתונים חדשים. עמודה A היא מזהה, עמודה B היא שינוי קיפול גולמי ועמודה C מותאמת לערך P. הפעל את קוד R כדי להתאים מזהים לקובץ יחיד המופרד באמצעות טאבים בפלטפורמות שונות ולאחר מכן ארגן ונרמל את הנתונים.
הוראות כלולות בתוך הקובץ. כל נתיב קובץ יופרד באמצעות קו נטוי קדימה עבור Mac OS או קו נטוי כפול קדימה עבור Windows. גבה את הקובץ המקורי.
פלט הקובץ המיוצר בסוף קובץ ציפוי משלים2 למיקום של בחירה לשימוש בשלב הבא. קובץ קידוד משלים2 יפלט קובץ Fold_Changes. קובץ txt.
בצע את הקוד הכלול בקובץ קידוד משלים3. חפש את קובץ הפלט בשם FC_DistribPlot. png בתיקיה שצוינה נתיב קובץ.
בדוק את ההפצות של Log2 Fold Change כדי לוודא שההפצות של Log2 Fold Change כמעט זהות בין ערכות נתונים. מוצג כאן ביטוי mRNA של GS TMS1 ו AGAP 009110 RA בשתי אוכלוסיות רב עמידות Anopheles Coluzzii מ Cote d'Ivoire, ו בורקינה פאסו, בהתאמה. השוואה למעבדה רגישים Anopheles Coluzzii N-Guzo גילה כי תעתיקים אלה מוסדרים באופן משמעותי בשתי אוכלוסיות מרובות עמידים נפרדים.
RNA-I המושרה להפיל בוצע על יתושים ממעבדת LSTM T-Oscillae המושבה. מקורה של מושבה זו בקוט ד'איבואר, והיא עמידה בפני כל המעמדות העיקריים של קוטל חרקים המשמשים לבריאות הציבור. ההנחיה של הביטוי של GS TMS1 הביאה לעלייה משמעותית בתמותה, לאחר חשיפה דלתא Matheran, לעומת GFP מוזרק פקדים, המדגים את החשיבות של תעתיק זה בהתנגדות Pyrethroid.
לעומת זאת, AGAP 009110 RA להפיל לא הביא לשינוי משמעותי בתמותה לאחר החשיפה. GST MS1 התבטא באופן משמעותי ב-20 מתוך 21 ערכות נתונים מיקרו-מערך הזמינות עבור מינים אלה. בכל מיקום, שינוי הקיפול היה גבוה משמעותית בעמידים, בהשוואה לאוכלוסיות הרגישות.
כל ערכות הנתונים הן מניסויים שונים לאורך שנים רבות, ולא תוכננו לגישה נקייה המבוססת על מיקרואנליזה, ולכן ייתכן שיהיה צורך להפחית את ההמחשה הנורמלית של ערך P. הערכה נוספת של הפלה פנוטיפית יכולה להתבצע עם קוטלי חרקים אחרים, ותכונות היסטוריה של החיים. אם יש תוצאות להיראות מספיק טוב, שיתוק במורד הזרם יכול לקבוע את התפקיד של חלבון.
טכניקה זו היא היישום הראשון המשלב נתונים תעתיקים על עמידות קוטלי חרקים של קומפלקס מינים Anopheles Gambiae ולהפוך אותו זמין לכל החוקרים בתחום זה.
