Dieses Protokoll ist von Bedeutung, da es das erste Mal ist, dass transkriptomische Daten bei Anopheles Gambiae-Mücken an einem Ort frei und leicht zugänglich gemacht wurden. Diese Technik ermöglicht es allen Forschern, auch denen ohne Hintergrund in der Bioinformatik, frei und einfach auf Expressionsdaten ihrer Lieblingsgene und insektizidresistenten Mücken zuzugreifen. Zunächst folgen Sie dem Link am unteren Rand der LSTM IR-TEx-Projektseite, um die IR-Tex-Webanwendung in einem Webbrowser auszuführen.
Nachdem die Webseite initialisiert wurde, klicken Sie oben auf der Seite auf die Schaltfläche Anwendung, die die Anwendung und die zugehörigen Ausgaben anzeigt. Lesen Sie jede Ausgabe im Zusammenhang mit dem Standardeintrag im Transkript-ID-Feld. Wählen Sie Bedingungen und Anopheles Coluzzii-Datensätze aus, die Pyrethroid-Insektiziden ausgesetzt sind oder keiner Insektizidklasse und zugehörigen Transkripten mit einem Korrelationskoeffizienten von mehr als 0,98 ausgesetzt sind.
Um den Ausdruck einer Transkription von Interesse zu untersuchen, wählen Sie zuerst das Transkript aus. Geben Sie dann die Transkript-ID in das Transkript-ID-Feld ein und speichern Sie, dass die Transkripte in RX abhängig von der Isoform des Interesses enden. Wählen Sie die zu behörenden Datensätze aus, indem Sie die entsprechenden Felder für Länder verwenden, einschließlich Expositionsstatus, Interessenarten und Insektizid-Interessensklasse.
Stellen Sie sicher, dass diese Kriterien zu mehr als einem enthaltenen Datensatz führen. Klicken Sie unten im Auswahlmenü auf Ansicht aktualisieren, oder drücken Sie Return, wobei Sie den absoluten Korrelationswert vorerst ignorieren. Geben Sie der Anwendung Zeit für die Aktualisierung.
Ob es sich um die erste Grafik mit dem Log2 Faltenwechsel zwischen einer resistenten Population und einer laboranfälligen Mückenpopulation der Transkriptionsmenge von Interesse in jedem Datensatz, der die ausgewählten Kriterien erfüllt, zeigt. Lesen Sie die Informationen unter dem Diagramm, wenn sich die Falten zwischen den resistenten und anfälligen Mücken für jeden relevanten Datensatz ändern, zusätzlich zu den zugeordneten angepassten P-Werten. Jede Zeile stellt einzelne Sonden auf dem Mikroarray dar.
Lesen Sie die nachstehende zusätzliche Tabelle, da die Anzahl der Experimente, bei denen die Abschrift von Interesse signifikant ist, sowie die Gesamtzahl der Experimente, die den ausgewählten Kriterien entsprechen, signifikant ist. Um die Daten im auf Registerkarten getrennten Format herunterzuladen, klicken Sie auf die Schaltfläche Herunterladen unter den beiden Tabellen. Auf diese Weise kann der Benutzer Daten mithilfe eines Programms wie Excel einfacher untersuchen.
Jeder Punkt auf der Karte stellt die ungefähren Sammelstellen resistenter Mücken in jedem Datensatz dar, in dem die Transkription von Interesse differenziert ausgedrückt wird. Die Farben folgen einem Ampelsystem, das in der App erklärt wird. Speichern Sie die grafischen Ausgaben, indem Sie mit der rechten Maustaste klicken, auf Bild speichern unter klicken und einen geeigneten Ordner auswählen.
Im Fall eines Ausgabefehlers der Anwendung ist es wahrscheinlich, dass keine Datensätze den eingegebenen Kriterien entsprechen. Korrelationen der Ausdrucksmuster von Transkripten über mehrere Datensätze hinweg können verwendet werden, um die Transkriptfunktion vorherzusagen und möglicherweise koregulierte Transkripte aus demselben Pfad aufzuklären. Bevor Sie auf Ansicht aktualisieren klicken, verschieben Sie den Schieberegler für den absoluten Korrelationswert auf 0,85, und klicken Sie auf Ansicht aktualisieren, oder drücken Sie Return.
Untersuchen Sie die Korrelationstabelle, um die mehreren Transkripte zu finden, die jetzt angezeigt werden und mit dem Eingegebenen und dem Transkript korreliert sind. Lesen Sie die Tabelle unter der grafischen Ausgabe, die den Korrelationswert für jedes Transkript enthält. Um die Daten in einem auf Registerkarten getrennten Format herunterzuladen, klicken Sie auf die Schaltfläche Herunterladen.
Bearbeiten Sie den Schieberegler für den absoluten Korrelationswert, und beobachten Sie alle Änderungen im unteren Diagramm und in der Tabelle. Eine niedrigere Stringenz des Korrelationswerts zeigt mehr Transkripte an, führt jedoch zu mehr Rauschen. Sobald der IR-TEx installiert ist, öffnen Sie RStudio Supplemental Coding File1 und führen Sie jede Zeile aus, um das System für IR-TEx einzurichten.
Sobald alle Pakete erfolgreich installiert und nach Bedarf aktualisiert wurden, gehen Sie zu Datei, Öffnen. Suchen Sie IR_TEx. r, markieren und öffnen.
Dies sollte nun im oberen Fenster von RStudio sichtbar sein. Um die App auszuführen, drücken Sie die Schaltfläche App ausführen oben rechts im Fenster. Es wird ein zweites Fenster angezeigt, in dem die App geladen wird.
Sobald das Laden abgeschlossen ist, klicken Sie für die volle Funktionalität auf Öffnen im Browser, oben rechts im geladenen Fenster. Der Benutzer kann dem IR-TEx, der mit dem Array Anopheles Gambiae 15k Agilent generiert wird, neue Widerstandsdatensätze hinzufügen, wie im TEx-Protokoll beschrieben. Öffnen Sie zusätzliche Datei2.txt.
Diese RNA-Suchdatei stellt die Vorlage dar, in der neue Daten basieren sollten. Spalte A ist Bezeichner, Spalte B ist unformatierte Faltenänderung und Spalte C wird P-Wert angepasst. Führen Sie den R-Code aus, um Bezeichner plattformübergreifend in einer einzelnen Datei mit Tabstopps abzugleichen, und organisieren und normalisieren Sie die Daten.
Anweisungen sind in der Datei enthalten. Jeder Dateipfad wird durch einen Schrägstrich für Mac OS oder einen doppelten Schrägstrich für Windows getrennt. Sichern Sie die Originaldatei.
Geben Sie die am Ende von Supplemental Coating File2 produzierte Datei an einen Ort ihrer Wahl aus, der im nächsten Schritt verwendet werden kann. Supplemental Coding File2 wird eine neue Fold_Changes ausgeben. txt-Datei.
Führen Sie den Code aus, der in Supplementary Coding File3 enthalten ist. Suchen Sie die Ausgabedatei mit dem Namen FC_DistribPlot. png in dem als Dateipfad angegebenen Ordner.
Überprüfen Sie die Verteilungen von Log2 Fold Change, um sicherzustellen, dass die Log2 Faltenänderungsverteilungen über alle Datensätze hinweg nahezu identisch sind. Hier ist die mRNA-Expression von GS TMS1 und AGAP 009110 RA in zwei multiresistenten Anopheles Coluzzii Populationen aus Cote d'Ivoire bzw. Burkina Faso zu sehen. Ein Vergleich mit den laboranfälligen Anopheles Coluzzii N-Guzo ergab, dass diese Transkripte in zwei separaten multiresistenten Populationen deutlich hochreguliert sind.
RNA-I induzierte Knock down wurde an Mücken aus dem LSTM Labor T-Oscillae Kolonie durchgeführt. Diese Kolonie stammt aus der Elfenbeinküste und ist resistent gegen alle wichtigen Klassen von Insektiziden, die in der öffentlichen Gesundheit verwendet werden. Die Dämpfung der Expression von GS TMS1 führte zu einem signifikanten Anstieg der Sterblichkeit nach DerDelta Matheran Exposition, im Vergleich zu GFP-injizierten Kontrollen, was die Bedeutung dieses Transkripts im Pyrethroid-Widerstand demonstrierte.
Umgekehrt führte der Abschlag von AGAP 009110 RA zu keiner signifikanten Veränderung der Sterblichkeit nach der Exposition. GST MS1 wurde in 20 von 21 für diese Arten verfügbaren Mikro-Array-Datensätzen deutlich übertroffen. An jedem Ort war die Faltenveränderung im Vergleich zu den anfälligen Populationen deutlich höher.
Alle Datensätze stammen aus verschiedenen Experimenten über viele Jahre und wurden nicht für einen sauberen mikroanalysebasierten Ansatz entwickelt, so dass es möglicherweise notwendig sein kann, die Normale P-Wert-Stringency zu senken. Weitere phänotypic Knock-down-Bewertung kann mit anderen Insektiziden durchgeführt werden, und lebensgeschichtliche Eigenschaften. Wenn es Ergebnisse gibt, die gut genug aussehen, kann die nachgeschaltete Parasitisierung die Rolle des Proteins bestimmen.
Diese Technik ist die erste Anwendung, um transkriptomische Daten über die Insektizidresistenz des Anopheles Gambiae-Artenkomplexes zu integrieren und sie allen Forschern auf diesem Gebiet zur Verfügung zu stellen.
