Questo protocollo è significativo, perché è la prima volta che i dati trascrittomici nelle zanzare Anopheles Gambiae sono stati resi liberamente e facilmente accessibili in un unico posto. Questa tecnica consente a tutti i ricercatori, anche a quelli senza background in bioinformatica, di accedere liberamente e facilmente ai dati di espressione sui loro geni preferiti e sulle zanzare resistenti agli insetticidi. Per iniziare, seguire il collegamento nella parte inferiore della pagina del progetto IR-TEx LSTM per eseguire l'applicazione Web IR-Tex in un browser Web.
Una volta inizializzata la pagina Web, fare clic sul pulsante Applicazione nella parte superiore della pagina, che mostrerà l'applicazione e gli output associati. Leggere ogni output relativo alla voce predefinita nella casella ID trascrizione. Selezionare le condizioni e i set di dati Anopheles Coluzzii esposti agli insetticidi piretroidi o non esposti a alcuna classe di insetticidi e trascrizioni associate con un coefficiente di correlazione superiore a 0,98.
Per esplorare l'espressione di una trascrizione di interesse, selezionare innanzitutto la trascrizione. Quindi, inserisci l'ID trascrizione nella casella ID trascrizione, ricordando che le trascrizioni terminano in RX a seconda dell'isoforma di interesse. Selezionare i set di dati da interrogare prendendo le caselle pertinenti per i paesi, tra cui lo stato di esposizione, le specie di interesse e la classe di interesse insetticida.
Assicurarsi che questi criteri si traducano in più di un set di dati incluso. Fare clic su Aggiorna visualizzazione nella parte inferiore del menu di selezione oppure premere Ritorno, ignorando per il momento il valore di correlazione assoluta. Concedere all'applicazione il tempo di aggiornamento.
Che sii il primo grafico ha il log2 fold change tra una popolazione resistente e una popolazione di zanzare suscettibile al laboratorio della trascrizione di interesse, in ogni set di dati che soddisfa i criteri selezionati. Leggere le informazioni sotto il grafico come modifiche di piegatura tra le zanzare resistenti e sensibili per ogni set di dati pertinente, oltre ai valori P regolati associati. Ogni riga rappresenta singole sonde sul micro array.
Leggi la tabella aggiuntiva qui sotto, come il numero di esperimenti in cui la trascrizione di interesse è significativa, così come il numero totale di esperimenti che corrispondono ai criteri selezionati. Per scaricare i dati in formato separato da schede, fare clic sul pulsante Scarica sotto le due tabelle. Ciò consente all'utente di esplorare i dati in modo più semplice, utilizzando un programma come Excel.
Ogni punto della mappa rappresenta i siti di raccolta approssimativi di zanzare resistenti in ogni set di dati, in cui la trascrizione dell'interesse è espressa in modo differenziato. I colori seguono un sistema semaforo che viene spiegato nell'app. Salvare gli output grafici facendo clic con il pulsante destro del mouse, scegliendo Salva immagine con nome e scegliendo una cartella appropriata.
Nell'istanza di un errore di output da parte dell'applicazione, è probabile che nessun set di dati corrisponda ai criteri immessi. Le correlazioni dei modelli di espressione delle trascrizioni tra più set di dati possono essere utilizzate per prevedere la funzione di trascrizione e potenzialmente chiarire trascrizioni co-regolate dallo stesso percorso. Prima di fare clic su Aggiorna visualizzazione, spostare il dispositivo di scorrimento del valore di correlazione assoluto su 0,85 e fare clic su Aggiorna visualizzazione o premere Ritorno.
Esaminare la tabella di correlazione per individuare le trascrizioni multiple ora visualizzate e correlate con l'input e la trascrizione. Leggere la tabella sotto l'output grafico, che contiene il valore di correlazione per ogni trascrizione. Per scaricare i dati in un formato separato da tabulazioni, fare clic sul pulsante Scarica.
Manipolate il dispositivo di scorrimento del valore di correlazione assoluto e osservate eventuali modifiche nella parte inferiore del grafico e della tabella. Un rigore inferiore del valore di correlazione mostrerà più trascrizioni, ma introdurrà più rumore. Una volta installato l'IR-TEx, aprire RStudio Supplemental Coding File1 ed eseguire ogni riga per configurare il sistema per IR-TEx.
Una volta che tutti i pacchetti sono stati installati e aggiornati correttamente in base alle esigenze, passare a File, Apri. Individuare IR_TEx. r, evidenziare e aprire.
Questo dovrebbe ora essere visibile nella finestra superiore di RStudio. Per eseguire l'app, premi il pulsante Esegui app in alto a destra nella finestra. Verrà visualizzata una seconda finestra in cui verrà caricata l'app.
Una volta completato il caricamento, per la piena funzionalità, fare clic su Apri nel browser, situato in alto a destra della finestra caricata. L'utente può aggiungere nuovi set di dati di resistenza all'IR-TEx generati utilizzando l'array Agilent Anopheles Gambiae 15k, come descritto nel protocollo TEx. Aprire File aggiuntivo2.txt.
Questo file di ricerca dell'RNA rappresenta il modello in cui devono essere basati i nuovi dati. La colonna A è identificatore, la colonna B è modifica piegata non elaborati e la colonna C viene regolata con il valore P. Eseguire il codice R in modo che corrisponda agli identificatori in un singolo file delimitato da tabulazioni tra piattaforme, quindi organizzare e normalizzare i dati.
Le istruzioni sono contenute nel file. Qualsiasi percorso di file sarà separato da una barra in avanti per Mac OS o da una doppia barra in avanti per Windows. Eseguire il backup del file originale.
Emettere il file prodotto alla fine del file di rivestimento supplementare2 in un percorso di scelta da utilizzare nel passaggio successivo. File di codifica supplementare2 emetterà un nuovo Fold_Changes. Txt.
Eseguire il codice contenuto in Supplementary Coding File3. Trovare il file di output denominato FC_DistribPlot. png nella cartella specificata come percorso del file.
Controllare le distribuzioni di Log2 Fold Change per verificare che le distribuzioni Log2 Fold Change siano quasi identiche tra i set di dati. Qui è mostrata l'espressione mRNA di GS TMS1 e AGAP 009110 RA in due popolazioni multiresistente di Anopheles Coluzzii rispettivamente dalla Costa d'Avorio e dal Burkina Faso. Il confronto con il laboratorio suscettibile Anopheles Coluzzii N-Guzo ha rivelato che queste trascrizioni sono significativamente regolate in due distinte popolazioni multiresistente.
Il knock down indotto dall'RNA-I è stato eseguito sulle zanzare del laboratorio LSTM T-Oscillae colony. Questa colonia proviene dalla Costa d'Avorio ed è resistente a tutte le principali classi di insetticidi utilizzati nella salute pubblica. L'attenuazione dell'espressione di GS TMS1 ha portato a un significativo aumento della mortalità, dopo l'esposizione di Delta Matheran, rispetto ai controlli iniettati dalla GFP, dimostrando l'importanza di questa trascrizione nella resistenza piretroide.
Al contrario, l'avaro di AGAP 009110 RA non ha comportato cambiamenti significativi nella mortalità dopo l'esposizione. GST MS1 è stato significativamente più espresso in 20 dei 21 set di dati micro-array disponibili per queste specie. In ogni luogo, il cambio di piega era significativamente più alto nella resistenza, rispetto alle popolazioni sensibili.
Tutti i set di dati provengono da diversi esperimenti nel corso di numerosi anni e non sono stati progettati per un approccio pulito basato sulla microanalisi, quindi potrebbe essere necessario abbassare il rigore del valore P normale. Ulteriore valutazione fenotipica knock down può essere eseguita con altri insetticidi e tratti della storia della vita. Se ci sono risultati abbastanza buoni, la parassitizzazione a valle può determinare il ruolo delle proteine.
Questa tecnica è la prima applicazione per integrare dati trascrittomici sulla resistenza insetticida del complesso di specie di Anopheles Gambiae e renderli disponibili a tutti i ricercatori in questo campo.
