Bu protokol önemlidir, çünkü Anopheles Gambiae sivrisineklerinde ilk kez transkripsiyonel veriler tek bir yerde serbestçe ve kolayca erişilebilir hale getirilmiştir. Bu teknik, biyoinformatik te geçmişi olmayanlar bile tüm araştırmacıların en sevdikleri genler ve insektisite dirençli sivrisinekler üzerindeki ifade verilerine özgürce ve kolayca erişmelerine olanak tanır. Başlamak için, IR-Tex Web uygulamasını bir Web tarayıcısında çalıştırmak için LSTM IR-TEx proje sayfasının altındaki bağlantıyı izleyin.
Web sayfası başolarak ortaya çıktıktan sonra, uygulama ve ilişkili çıktıları görüntüleyen sayfanın üst kısmındaki Uygulama düğmesini tıklatın. Transkript kimliği kutusundavarsayılan girişle ilgili her çıktıyı okuyun. Pyrethroid insektisitlere maruz kalan veya herhangi bir insektisit sınıfına ve 0,98'den büyük korelasyon katsayısına sahip ilişkili transkriptlere maruz olmayan koşulları ve Anopheles Coluzzii veri kümelerini seçin.
İlgi çekici bir transkriptin ifadesini incelemek için önce transkripti seçin. Daha sonra transkript kimliğini transkript kimliği kutusuna girerek, transkriptlerin RX'te sona erdiğini hatırlayın. Maruz kalma durumu, ilgi türleri ve insektisit sınıfı da dahil olmak üzere ülkeler için ilgili kutuları alarak sorgulamak için veri kümelerini seçin.
Bu ölçütlerin birden fazla dahil veri kümesiyle sonuçlandırıldığından emin olun. Seçim menüsünün altındaki Görünümü Güncelleştir'i tıklatın veya şimdilik mutlak korelasyon değerini yoksayarak İade tuşuna basın. Uygulamanın güncelleştirilen zaman vermesini.
İlk grafik, dirençli bir popülasyon arasında Log2 Kat Değişimi ve seçilen kriterleri karşılayan her veri seti arasında ilgi transkript bir laboratuvar duyarlı sivrisinek nüfus vardır. İlgili her veri kümesi için dirençli ve duyarlı sivrisinekler arasındaki Kat Değişiklikleri olarak grafiğin altındaki bilgileri okuyun, Ilişkili ayarlanmış P değerlerine ek olarak. Her satır, mikro dizideki tek tek probları temsil eder.
İlgi dökümünün önemli olduğu deneme sayısı ve seçilen ölçütlerile eşleşen toplam deneme sayısı olarak aşağıdaki ek tabloyu okuyun. Verileri sekme ayrılmış biçiminde indirmek için, iki tablonun altındaki İndir düğmesini tıklatın. Bu, excel gibi bir programı kullanarak kullanıcının verileri daha kolay bir şekilde keşfetmesini sağlar.
Haritadaki her nokta, ilgi nin farklı olarak ifade edildiği her veri kümesindeki dirençli sivrisineklerin yaklaşık toplama alanlarını temsil eder. Renkler, uygulamada açıklanan bir trafik ışığı sistemini izler. Resim Çıktılarını sağ tıklatarak, Resim Olarak Kaydet'e tıklayarak ve uygun bir klasör seçerek kaydedin.
Uygulama tarafından yapılan bir çıktı hatası durumunda, hiçbir veri kümesinin giriş ölçütleri ile eşleşmesi olasıdır. Transkriptlerin birden çok veri kümesi arasındaki ifade kalıplarının korelasyonları, transkript işlevini tahmin etmek ve aynı yoldaki birlikte düzenlenmiş transkriptleri açıklığa kavuşturmak için kullanılabilir. Görünüm'ü güncelleştir'i tıklatmadan önce, mutlak korelasyon değeri kaydırıcısını 0,85'e taşıyın ve Görünümü Güncelleştir'e veya İade'ye basın.
Şu anda görüntülenen ve giriş ve transkript ile ilişkili birden fazla transkript bulmak için Korelasyon Tablosunu inceleyin. Her transkript için korelasyon değerini içeren grafik çıktısının altındaki tabloyu okuyun. Verileri sekme ayrılmış biçiminde indirmek için İndir düğmesini tıklatın.
Mutlak korelasyon değeri kaydırıcısını manipüle edin ve en alttaki grafik ve tablodaki değişiklikleri gözlemleyin. Korelasyon değerinin daha düşük bir sıkılığı daha fazla transkript gösterir, ancak daha fazla gürültü getirecektir. IR-TEx yüklendikten sonra RStudio Tamamlayıcı Kodlama Dosyası1'i açın ve IR-TEx için sistemi kurmak için her satırı çalıştırın.
Tüm paketler başarıyla yüklendikten ve gerektiği gibi güncelleştirildikten sonra Dosya, Aç'a gidin. IR_TEx bulun. r, vurgulamak ve açın.
Bu şimdi RStudio üst penceresinde görünür olmalıdır. Uygulamayı çalıştırmak için pencerenin sağ üst kısmındaki Uygulamayı Çalıştır düğmesine basın. Uygulamanın yüklendiği ikinci bir pencere açılır.
Yükleme tamamlandıktan sonra, tam işlevsellik için, yüklenen pencerenin sağ üst kısmında bulunan Tarayıcıda Aç'ı tıklatın. Kullanıcı, TEx protokolünde açıklandığı gibi Anopheles Gambiae 15k Agilent dizisi kullanılarak oluşturulan IR-TEx'e yeni direnç veri setleri ekleyebilir. Ek Dosya2.txt açın.
Bu RNA arama dosyası, yeni verilerin temel alınması gereken şablonu temsil eder. Sütun A tanımlayıcıdır, B sütunu ham Kat Değişimi ve C sütunu P değeri ayarlanır. Tanımlayıcıları platformlar arasında tek bir sekme yle sınırlandıran dosyada eşleştirmek için R kodunu çalıştırın ve ardından verileri düzenleyin ve normalleştirin.
Talimatlar dosya içinde yer almaktadır. Herhangi bir dosya yolu Mac OS için bir ileri eğik çizgi veya Windows için bir çift ileri eğik çizgi ile ayrılır. Orijinal dosyayı yedekle.
Tamamlayıcı Kaplama Dosyası2'nin sonunda üretilen dosyayı bir sonraki adımda kullanılmak üzere tercih edilen bir konuma çıktı. Ek Kodlama File2 yeni bir Fold_Changes çıktı olacaktır. txt dosyası.
Ek Kodlama Dosyası3'te yer alan kodu çalıştırın. FC_DistribPlot adlı çıktı dosyasını bulun. dosya yolu olarak belirtilen klasörde png.
Log2 Fold Change dağıtımlarının veri kümeleri arasında neredeyse aynı olduğunu doğrulamak için Log2 Kat Değişikliği dağıtımlarını kontrol edin. Burada gösterilen Cote d'Ivoire iki çok dirençli Anopheles Coluzzii popülasyonlarında GS TMS1 ve AGAP 009110 RA mRNA ifadesi, ve Burkina Faso, sırasıyla. Laboratuvar duyarlı Anopheles Coluzzii N-Guzo ile karşılaştırıldığında bu transkriptler önemli ölçüde yukarı-iki ayrı çok dirençli popülasyonlarda düzenlenir ortaya koymuştur.
RNA-I indüklenen knock down LSTM laboratuvar T-Oscillae kolonisivrisinek üzerinde yapıldı. Bu koloni Fildişi Sahili'nden gelmektedir ve halk sağlığında kullanılan tüm büyük böcek ilaçlarına karşı dayanıklıdır. GS TMS1 ekspresyonunun zayıflatılması, Delta Matheran maruziyetinden sonra, GFP enjekte edilen kontrollere kıyasla mortalitede önemli bir artışa yol açmış ve pyrethroid direncinde bu transkriptin önemini göstermiştir.
Tersine, AGAP 009110 RA knock down maruz kaldıktan sonra mortalitede önemli bir değişiklik ile sonuçlandı. GST MS1, bu türler için mevcut olan 21 mikro dizi veri kümesinin 20'sinde önemli ölçüde üzerinde ifade edildi. Her yerde, Kat Değişimi duyarlı popülasyonlara göre dirençli olarak önemli ölçüde daha yüksekti.
Tüm veri setleri yıllar boyunca farklı deneylerden elde edilir ve temiz bir mikroanaliz tabanlı yaklaşım için tasarlanmamaktadır, bu nedenle normal P değeri sıkılığını düşürmek gerekebilir. Daha fazla Phenotypic yıkmak değerlendirme diğer insektisitler ile yapılabilir, ve yaşam öyküsü özellikleri. Sonuçlar yeterince iyi görünüyorsa, aşağı parazitizasyon proteinin rolünü belirleyebilir.
Bu teknik, Anopheles Gambiya türü kompleksinin insektisit direnci nesle metatomik verileri entegre etmek ve bu alandaki tüm araştırmacıların kullanımına sunulan ilk uygulamadır.
