שיטה זו מועילה לזהות, ולהפוך סמנים ביולוגיים מרובים לאוקליזציה במשותף בהקפאה אחת, כולל סמנים שאינם ניתנים לגילוי בדרך כלל במקטעי פרפין. בשיטת הכתמים הניסיונית הזו, זמן הכתמים מצטמצם משמעותית ושיטת ההכתמה יכולה להתבצע בכל מעבדה. הדגמת שיטה זו תהיה דינש ג'ישנקר.
הוא פוסט-דוק מיומן מהמעבדה, וגם ליבת הערכת האימונותרפיה, מנהל המתקנים. בעת בחירת נוגדנים לניתוח, שקול את ערכות מסנן העירור וההפחתה הזמינות במערכת ההדמיה האוטומטית למחצה. ולאחר בדיקת שילובים שונים של נוגדנים ראשוניים פלואורופור הוסיף, להכין פלואורופורים לשמש, כך שיש לך חפיפה ספקטרלית מינימלית כפי שהוצע בטבלה.
להכתמת מולטיפלקס, הכינו קוקטייל של נוגדנים עם פלואורופורים תואמים בהזיות אופטימליות קבועות מראש, ומוסיפים את הקוקטייל לחלקי הרקמות המעניינים. להכתמת סמן יחיד, הוסיפו את הנוגדן ההצטייד העיקרי רק לשקופית. עבור כל הכתמים, כוללים שקופית שליטה מוכתמת שעוברת את אותו הליך הכתם ללא תוספת של נוגדן תיעב ראשוני.
לאחר דגירה של שעה בטמפרטורת החדר מוגנת מפני אור, לשטוף את המגלשות פעמיים עם PBS במשך חמש דקות לכל לשטוף. לאחר הכביסה השנייה, הדלפק מכתים את השקופיות המוכתמות מולטיפלקס עם DAPI במשך שבע דקות בטמפרטורת החדר מוגן מפני אור, ואחריו שתי שטיפות חמש דקות PBS. כדי ליצור ספריה ספקטרלית, הגדר את כוח המנורה של מערכת ההדמיה הרב-ספקטרלית ל- 100%ופתח את תוכנת ההפעלה של המיקרוסקופ.
בחר ערוך פרוטוקול ופרוטוקול חדש. הזן שם פרוטוקול ובחר פלואורסצנטיות במצב דימות. לאחר מכן ספק שם לימוד וטען את השקופיות המוכתמות היחידות על הבמה.
לחצו על 'ערוך חשיפה' ולהשתמש באפשרויות המיקוד האוטומטי והחשיפה האוטומטית להתאמת זמני החשיפה ולרכוש תמונות לשקופיות המוכתמות הבודדות. לאחר הדמיית השקופיות המוכתמות הבודדות, שמור את הפרוטוקול. ובתוכנות למידת המכונה תחת הכרטיסייה בניית ספריה, טען כל תמונה מוכתמת בודדת.
בחר את הרצפה המתאימה ולחץ על חלץ. התוכנה תחלץ באופן אוטומטי את אות הפלואורסצנט שנבחר ברצפה. כדי לשמור את הצבע שחולץ, לחץ על שמור לאחסון.
ניתן ליצור קבוצה חדשה או לאחסן את הצבע שחולץ בקבוצה קיימת. להדמיה רב-ספקטרלית, לאחר שהספריה הספקטרלית נוצרה ואומתה, התאימו את זמני המיקוד והחשיפה בשקופית המוכתמת מולטיפלקס כפי שהוכח, ופתיחת שקופיות סרוקות ליצירת משימה חדשה. ספק מזהה שקופית ובחר פרוטוקול.
תחת משימה, בחר סריקת שקופיות שלמה כדי לבצע סריקת שקופיות שלמה בשקופית המוכתמת מולטיפלקס. בתדמית סריקת השקופיות כולה, בחר אזורים מעניינים לאורך התמונה. אזורים אלה ייסרקו באמצעות זמני החשיפה שנקבעו קודם לכן בשקופית מולטיפלקס שישמשו לחשיפה וניתוח ספקטרליים.
בתוכנת ההפעלה מיקרוסקופ, בחר לרכוש שדות MSI תחת משימה ולאחר מכן לחץ על עבד שקופית כדי לרכוש אזורי עניין בהגדלה של פי 20. לאחר שאזורי העניין נרכשו, בתוכנת למידת המכונה, לחץ על קובץ ופתיחה תחת לשונית הניתוח הידנית כדי לטעון את התמונות המוכתמות מולטיפלקס. בחרו במקור הספרייה הספקטרלית ולחצו על 'בחר רצפות' לבחירת הספרייה הספקטרלית שנשמרה קודם לכן.
לחץ על קובץ ופתיחה כדי לטעון את התמונה שאינה נגועה. לאחר מכן לחץ על סמל סמן הדיו autofluorescence וצייר קו או אזור בשקופית שאינה מוכתמת כדי לזהות שפעת אוטומטית בתוך הרקמה. לאחר מכן, תחת הכרטיסיה עריכת סמנים וצבעים, הקצה שמות עבור כל סמן ולחץ על הכן הכל.
לאחר אימות התמונה ללא מעצורים ספקטרלית, בתוכנת למידת המכונה, בחרו באפשרויות הממברנה והסמן של הציטופלסמה מהחלונית. ושימוש בלחצן שלוש הנקודות, בחר להשתמש באות זה כדי למצוא, כדי להגדיר את הסמן כדי לזהות את הגרעינים, ציטופלסמה או קרום. כאשר נבחר סמן ציטופלסמי או ממברנה, בחר באפשרות השתמש באות כדי לסייע בפיצול גרעיני.
התוכנה תזהה ותיצור באופן אוטומטי מסכות בודדות עבור הגרעין, הציטופלסמה והממברנה. השתמש בתצוגת הפתולוגיה עבור סמן מסוים ובאפשרויות התצורה בתוכנה כדי להתאים את מסיכות, ולחץ על פלח הכל כדי ליצור מפת פילוח תאים. לאחר פילוח התאים, בחר את סמנים כדי phenotype התאים החיוביים.
בנוסף, בחר לפחות חמישה תאים שלא מוכתמים בסמן שנבחר כדי להפנוטיפ את התאים השליליים. לאחר מכן לחץ על מאמן מסווג כדי לאמן את התוכנה לזהות באופן אוטומטי את כל התאים המוכתמים עם סמנים שנבחרו בתוך התמונה. מפת פנוטיפים תיווצר.
כפי שתמונות אלה מדגימות, נוגדנים מאומתים עבור ציטומטריית זרימה יכולים לשמש כדי לדמיין כתמי רקמות באמצעות מסנן הגביש הנוזלי הניתן לכוונון במערכת ההדמיה האוטומטית למחצה. כאן ניתן לראות תמונה לא מרוכגת של שקדים אנושיים קפואים הכוללת תיוג של תאי B ותאים מתרבים בתוך המרכז הנבט הזקיקי, ואזור תאי T הבין-זקיקיים. אפשרות ההשקפות הפתולוגיות מאפשרת הדמיה של תבנית הכתמים הבודדת עבור כל סמן בתוך הרקמה המעניינים, מה שמרמז על כך ששיטת הכתמים מולטיפלקס והדמיה ספקטרלית עובדות על רקמה קפואה.
כפי שהודגם על קטע גידול עכבר קפוא, הדמיה multispectral יכול לשמש גם כדי לדמיין גידול חודר תאי T, ושושלת תאים מיאלואידיים אחרים כולל מקרופאגים הקשורים הגידול. פילוח תאים ומפות פנוטיפים, ואת מספר התאים המוכתמים עבור כל סמן שנותח על ידי התוכנה ניתן ליצור, המוכיח כי התוכנה יכולה לשמש לכמות של כתמים multispectral על רקמות קפואות. עבור מישהו חדש 6to הטכניקה, חשוב להכיר את התכונות הספציפיות של הפלואורוכרומים שלך, ולהכין שקופיות ספרייה איכותיות עבור ספקטרלי unmixing עם חפיפה ספקטרלית מינימלית.
חשוב גם לבצע טיטרציה נוגדנים. לדעתנו, שיטה זו יכולה לספק מידע ליד המיטה על היעילות של אימונותרפיה לסרטן ויישומים טיפוליים אחרים, במיוחד כאשר העיתוי הוא המהות.
