Este método es útil para detectar y co-localizar varios biomarcadores en una sola criosecta, incluidos marcadores que normalmente no se pueden detectar en secciones de parafina. Utilizando este método de tinción experimental, el tiempo de tinción se reduce significativamente y el método se puede realizar en cualquier laboratorio. Demostrar este método será Dinesh Jaishankar.
Es un experto postdoctorado del laboratorio, y también el Núcleo de Evaluación de Inmunoterapia, Gerente de Instalaciones. Al seleccionar anticuerpos para el análisis, tenga en cuenta los conjuntos de filtros de excitación y emisión disponibles en el sistema de imágenes semiautomático. Y después de probar varias combinaciones de anticuerpos primarios conjugados con fluoróforo, prepare los fluoróforos para que se utilicen de modo que tenga una superposición espectral mínima como se sugiere en la tabla.
Para la tinción multiplex, preparar un cóctel de anticuerpos con fluoróforos compatibles en delirios óptimos predeterminados, y añadir el cóctel a las secciones de tejido de interés. Para la tinción de un solo marcador, agregue el anticuerpo conjugado primario solo a la diapositiva. Para todas las tinciones, incluya un portaobjetos sin manchar de control que se someta al mismo procedimiento de tinción sin la adición de un anticuerpo conjugado primario.
Después de una incubación de una hora a temperatura ambiente protegida de la luz, lave los portaobjetos dos veces con PBS durante cinco minutos por lavado. Después del segundo lavado, el contador mancha los portaobjetos múltiplex con DAPI durante siete minutos a temperatura ambiente protegido de la luz, seguido de dos lavados de cinco minutos en PBS. Para crear una biblioteca espectral, establezca la potencia de la lámpara del sistema de imágenes multiespectrales en 100% y abra el software operativo del microscopio.
Seleccione Editar protocolo y nuevo protocolo. Introduzca un nombre de protocolo y seleccione Fluorescencia en modo de imagen. A continuación, proporcione un nombre de estudio y cargue las diapositivas manchadas individuales en el escenario.
Haga clic en Editar exposición y utilice las opciones de enfoque automático y exposición automática para ajustar los tiempos de exposición y adquirir instantáneas para las diapositivas manchadas individuales. Después de tomar imágenes de las diapositivas manchadas individuales, guarde el protocolo. Y en el software de aprendizaje automático en la pestaña Biblioteca de compilación, cargue cada imagen manchada.
Seleccione el suelo adecuado y haga clic en Extraer. El software extraerá automáticamente la señal fluorescente seleccionada en el suelo. Para guardar el color extraído, haga clic en Guardar para almacenar.
Se puede crear un nuevo grupo o el color extraído se puede almacenar en un grupo existente. Para imágenes multiespectrales, una vez creada y verificada la biblioteca espectral, ajuste los tiempos de enfoque y exposición en la diapositiva teñida de multiplex como se ha demostrado y abra las diapositivas escaneadas para crear una nueva tarea. Proporcione un ID de diapositiva y seleccione un protocolo.
En la tarea, seleccione el escaneo completo de la diapositiva para realizar un escaneo de diapositivas completo en la diapositiva manchada de multiplex. En toda la imagen de escaneo de diapositivas, seleccione regiones de interés en toda la imagen. Estas regiones se escanearán utilizando los tiempos de exposición previamente establecidos en la diapositiva multiplex que se utilizará para la desmezcla y el análisis espectral.
En el software operativo del microscopio, seleccione adquirir campos MSI en tarea y, a continuación, haga clic en Procesar diapositiva para adquirir regiones de interés con un aumento de 20 veces. Una vez adquiridas las regiones de interés, en el software de aprendizaje automático, haga clic en Archivo y abrir en la pestaña de análisis manual para cargar las imágenes manchadas multiplex. Seleccione el origen de la biblioteca espectral y haga clic en Seleccionar pisos para elegir la biblioteca espectral guardada anteriormente.
Haga clic en Archivo y Abrir para cargar la imagen no manchada. A continuación, haga clic en el icono de marcador de tinta de autofluorescencia y dibuje una línea o región en la diapositiva no manchada para identificar la autofluorescencia dentro del tejido. A continuación, en la pestaña Editar marcadores y colores, asigne nombres para cada marcador y haga clic en Preparar todo.
Después de verificar la imagen espectralmente no mezclada, en el software de aprendizaje automático, seleccione las opciones de membrana y marcador de citoplasma en el panel. Y usando el botón de puntos suspensivos, seleccione utilizar esta señal para encontrar, para configurar el marcador para detectar los núcleos, citoplasma o membrana. cuando se elija un marcador citoplasmático o de membrana, seleccione la opción Usar la señal para ayudar en la división nuclear.
El software detectará y creará automáticamente máscaras individuales para el núcleo, el citoplasma y la membrana. Utilice la vista de patología para un marcador específico y las opciones de configuración del software para ajustar las máscaras y haga clic en Segmentar todo para crear un mapa de segmentación de celdas. Después de la segmentación celular, seleccione los marcadores para fenotipo las celdas positivas.
Además, seleccione al menos cinco celdas que no estén manchadas con el marcador elegido para fenotipo las celdas negativas. A continuación, haga clic en Clasificador de trenes para entrenar el software para detectar automáticamente todas las celdas manchadas con los marcadores seleccionados dentro de la imagen. Se creará un mapa de fenotipos.
Como demuestran estas imágenes, los anticuerpos validados para la citometría de flujo podrían utilizarse para visualizar la tinción de tejido utilizando el filtro de cristal líquido sintonizable en el sistema de imágenes semiautomat automatizado. Aquí se puede observar una imagen espectralmente no mezclada de amígdalas humanas congeladas que incluye el etiquetado de células B y células proliferantes dentro del centro germinal folicular, y la región de células T interfoliculares. La opción de vistas patológicas permite visualizar el patrón de tinción individual para cada marcador dentro del tejido de interés, lo que sugiere que el método de tinción multiplex y las imágenes espectrales funcionan en tejido congelado.
Como se muestra en una sección de tumor de ratón congelado, las imágenes multiespectrales también se pueden utilizar para visualizar las células T infiltrantes de tumores y otros linajes celulares mieloides, incluidos los macrófagos asociados a tumores. Se pueden generar mapas de segmentación y fenotipo de células, y el número de células manchadas para cada marcador analizado por el software, lo que demuestra que el software se puede utilizar para la cuantificación de la tinción multiespectral en tejidos congelados. Para alguien nuevo 6a la técnica, es importante conocer las características específicas de sus fluorocromos, y preparar diapositivas de biblioteca de calidad para la desmezcla espectral con una superposición espectral mínima.
También es importante realizar la valoración de anticuerpos. En nuestra opinión, este método puede proporcionar información junto a la cama sobre la eficacia de la inmunoterapia para el cáncer y otras aplicaciones terapéuticas, particularmente cuando el tiempo es esencial.
