Bu yöntem, parafin kesitlerinde normalde saptanamayan belirteçler de dahil olmak üzere tek bir kriyodinde birden fazla biyobelirteçsapları algılamak ve birlikte yerelleştirmek için yararlıdır. Bu deneysel boyama yöntemi kullanılarak boyama süresi önemli ölçüde azalır ve yöntem herhangi bir laboratuvarda yapılabilir. Bu yöntemi gösteren Dinesh Jaishankar olacaktır.
O laboratuvardan yetenekli bir postdoc, ve aynı zamanda İmmünoterapi Değerlendirme Çekirdek, Tesis Yöneticisi. Analiz için antikor seçerken, yarı otomatik görüntüleme sisteminde bulunan uyarma ve emisyon filtresi kümelerini göz önünde bulundurun. Ve florofor konjuge primer antikorların çeşitli kombinasyonları test ettikten sonra, tabloda önerildiği gibi minimal spektral örtüşme var, böylece kullanılmak üzere floroforlar hazırlamak.
Multipleks boyama için, önceden belirlenmiş optimal sanrılarda uyumlu floroforlarla bir antikor kokteyli hazırlayın ve kokteyli ilgi çekici doku bölümlerine ekleyin. Tek belirteç boyama için, birincil konjuge antikor sadece slayt ekleyin. Tüm lekeler için, birincil konjuge antikor ilave sayılmadan aynı boyama işleminden geçen bir kontrol lekesiz slayt içerir.
Işıktan korunan oda sıcaklığında bir saatlik kuluçkadan sonra, slaytları pbs ile iki kez yıkama başına beş dakika yıkayın. İkinci yıkamadan sonra, oda sıcaklığında ışıktan korunan oda sıcaklığında yedi dakika boyunca DAPI ile çok katlı kızakları lekeleyin ve ardından PBS'de iki beş dakikalık yıkayıcılar. Spektral bir kitaplık oluşturmak için, multispektral görüntüleme sisteminin lamba gücünü %100'e ayarlayın ve mikroskop işletim yazılımını açın.
Protokolü Ve yeni protokolü Edit'i seçin. Bir protokol adı girin ve görüntüleme modu altında Floresan'ı seçin. Sonra bir çalışma adı verin ve tek lekeli slaytları sahneye yükleyin.
Pozlamayı Edit'i tıklatın ve pozlama sürelerini ayarlamak ve tek lekeli slaytlar için anlık görüntüler elde etmek için otomatik odaklama ve otomatik pozlama seçeneklerini kullanın. Tek lekeli slaytları görüntüledikten sonra protokolü kaydedin. Yapı Kitaplığı sekmesi altındaki makine öğrenimi yazılımında, her bir lekeli görüntüyü yükleyin.
Uygun katı seçin ve Ayıkla'yı tıklatın. Yazılım, zeminde seçilen floresan sinyali otomatik olarak ayıklar. Çıkarılan rengi kaydetmek için depolamak için Kaydet'i tıklatın.
Yeni bir grup oluşturulabilir veya çıkarılan renk varolan bir gruba depolanabilir. Multispektral görüntüleme için, spektral kitaplık oluşturulduktan ve doğrulandıktan sonra, çok katlı slayttaki odak ve pozlama sürelerini gösterildiği gibi ayarlayın ve yeni bir görev oluşturmak için taranmış slaytları açın. Slayt kimliği sağlayın ve bir protokol seçin.
Görev altında, multipleks lekeli slayt üzerinde bir slayt tam slayt tayini gerçekleştirmek için tüm slayt tayini seçin. Slayt tonu görüntüsünün tamamında, görüntü boyunca ilgi çekici bölgeleri seçin. Bu bölgeler, spektral karıştırma ve analiz için kullanılacak multipleks slaytta önceden ayarlanmış pozlama süreleri kullanılarak taranır.
Mikroskop işletim yazılımında, görev altındaki MSI alanlarını edinin'i seçin ve ardından 20x büyütmede ilgi çekici bölgeleri elde etmek için İşlem Slaytı'nı tıklatın. İlgi alanları alındıktan sonra, makine öğrenme yazılımında, çok katlı lekeli görüntüleri yüklemek için manuel analiz sekmesinin altındaki Dosya ve Aç'ı tıklatın. Spektral kitaplık kaynağını seçin ve daha önce kaydedilmiş spektral kitaplığı seçmek için Katları Seç'i tıklatın.
Lekelenmemiş görüntüyü yüklemek için Dosya ve Aç'ı tıklatın. Ardından otofloresan mürekkep işaretçisi simgesini tıklatın ve doku içindeki otofloresanlığı tanımlamak için lekesiz slayta bir çizgi veya bölge çizin. Daha sonra İşaretçileri ve Renkleri Edit sekmesinin altında, her işaretçi için adatlayın ve Tümlerini Hazırla'yı tıklatın.
Makine öğrenme yazılımında, spekülasyonel karışık olmayan görüntüyü doğruladıktan sonra panelden sitoplazma membranı ve işaretleme seçeneklerini seçin. Ve elips düğmesini kullanarak, bulmak için bu sinyali kullanın seçin, çekirdeği, sitoplazma veya membran ya algılamak için işaretleyici yapılandırmak için. bir sitoplazmik veya membran belirteci seçildiğinde, nükleer bölme seçeneğine yardımcı olmak için Sinyali Kullanın'ı seçin.
Yazılım otomatik olarak algılar ve çekirdek, sitoplazma ve membran için bireysel maskeler oluşturmak. Maskeleri ayarlamak için belirli bir işaretçi için patoloji görünümünü ve yazılımdaki yapılandırma seçeneklerini kullanın ve hücre segmentasyon eşlemi oluşturmak için Tümler'i tıklatın. Hücre segmentasyonundan sonra, pozitif hücreleri fenotiplemek için işaretleri seçin.
Ayrıca, negatif hücreleri fenotiplemek için seçilen işaretçiyle lekeli olmayan en az beş hücre seçin. Ardından, görüntüiçinde seçili işaretçilerle boyanmış tüm hücreleri otomatik olarak algılamak için yazılımı eğitmek için Train Classifier'i tıklatın. Bir fenotip haritası oluşturulur.
Bu görüntülerin de gösterdiği gibi, akış sitometrisi için doğrulanmış antikorlar, yarı otomatik görüntüleme sistemindeki sıvı kristal kullanılabilir filtreyi kullanarak doku boyamasını görselleştirmek için kullanılabilir. Burada dondurulmuş insan bademcik bir spectrally unmixed görüntü foliküler germinal merkezi içinde B-hücreleri ve Çoğalan hücrelerin etiketleme içeren görülebilir, ve inter foliküler T-hücre bölgesi. Patoloji görünümleri seçeneği, ilgi doku içinde her belirteç için bireysel boyama deseni görselleştirme sağlar, bu çokkatlı boyama yöntemi ve dondurulmuş doku üzerinde spektral görüntüleme çalışması düşündürmektedir.
Dondurulmuş fare tümörü bölümünde gösterildiği gibi, multispektral görüntüleme de tümör t-hücreleri infiltrasyon görselleştirmek için kullanılabilir, ve tümör ilişkili makrofajlar da dahil olmak üzere diğer miyeloid hücre soyları. Hücre segmentasyonu ve fenotip haritaları ve yazılım tarafından analiz edilen her bir belirteç için lekeli hücre sayısı oluşturulabilir, bu da yazılımın dondurulmuş dokularda çoklu spektral boyamanın ölçülmesi için kullanılabileceğini gösterir. Teknik6to yeni biri için, florokromların belirli özelliklerini tanımak ve en az spektral örtüşme ile spektral karıştırma için kaliteli kütüphane slaytları hazırlamak önemlidir.
Antikor titrasyonu yapmak da önemlidir. Bizim görüşümüze göre, bu yöntem kanser ve diğer terapötik uygulamalar için immünoterapi etkinliği hakkında başucu bilgi sağlayabilir, özellikle zamanlama özü ise.
