이 방법은 파라핀 섹션에서 일반적으로 검출할 수 없는 마커를 포함하여 단일 극저온 섹션에서 여러 바이오마커를 검출하고 공동 국소화하는 데 도움이 됩니다. 이러한 실험염색 방법을 사용하여 염색 시간이 현저히 감소하고 모든 실험실에서 방법을 수행할 수 있다. 이 방법을 시연하는 것은 디네시 자이샨카르입니다.
그는 실험실에서 숙련 된 postdoc, 또한 면역 요법 평가 코어, 시설 관리자. 분석을 위해 항체를 선택할 때 반자동 이미징 시스템에서 사용할 수 있는 여기 및 방출 필터 세트를 고려하십시오. 그리고 형광소의 다양한 조합을 테스트 한 후 1 차 항체를 공각 한 후, 당신이 테이블에 제안 된 바와 같이 최소한의 스펙트럼 중복을 갖도록 사용되는 형광을 준비.
멀티플렉스 염색의 경우, 미리 정해진 최적의 망상에서 호환되는 형광과 함께 항체의 칵테일을 준비하고, 관심있는 조직 섹션에 칵테일을 추가하십시오. 단일 마커 염색의 경우, 슬라이드에만 1차 공조 항체를 추가합니다. 모든 염색에 대해, 1차 공각 항체를 첨가하지 않고 동일한 염색 절차를 겪는 제어 미염색 슬라이드를 포함한다.
빛으로부터 보호되는 실온에서 1시간 동안 잠복한 후 PBS로 슬라이드를 세척당 5분 동안 두 번 세척합니다. 두 번째 세척 후, 카운터는 빛으로부터 보호 실온에서 7 분 동안 DAPI와 멀티 플렉스 스테인드 슬라이드를 얼룩, PBS에서 두 5 분 세척. 스펙트럼 라이브러리를 만들려면 다중 스펙트럼 이미징 시스템의 램프 전력을 100%로 설정하고 현미경 작동 소프트웨어를 엽니다.
프로토콜 편집 및 새 프로토콜을 선택합니다. 프로토콜 이름을 입력하고 이미징 모드에서 형광을 선택합니다. 그런 다음 스터디 이름을 제공하고 단일 스테인드 슬라이드를 스테이지에 로드합니다.
노출 편집을 클릭하고 자동 초점 및 자동 노출 옵션을 사용하여 노출 시간을 조정하고 단일 스테인드 슬라이드에 대한 스냅숏을 얻습니다. 단일 스테인드 슬라이드를 이미징한 후 프로토콜을 저장합니다. 그리고 빌드 라이브러리의 탭 아래의 기계 학습 소프트웨어에서 각 스테인드 이미지를 로드합니다.
적절한 바닥을 선택하고 추출을 클릭합니다. 이 소프트웨어는 자동으로 바닥에서 선택한 형광 신호를 추출합니다. 추출된 색상을 저장하려면 저장을 클릭하여 저장합니다.
새 그룹을 만들거나 추출된 색상을 기존 그룹에 저장할 수 있습니다. 다중 스펙트럼 이미징의 경우 스펙트럼 라이브러리가 만들어지고 확인되면 멀티플렉스 스테인드 슬라이드의 초점 및 노출 시간을 설명한 대로 조정하고 스캔된 슬라이드를 열어 새로운 작업을 만듭니다. 슬라이드 ID를 제공하고 프로토콜을 선택합니다.
작업에서 전체 슬라이드 스캔을 선택하여 멀티플렉스 스테인드 슬라이드에서 전체 슬라이드 스캔을 수행합니다. 전체 슬라이드 스캔 이미지에서 이미지 전체의 관심 영역을 선택합니다. 이러한 영역은 스펙트럼 언믹싱 및 분석에 사용되는 멀티플렉스 슬라이드에서 이전에 설정된 노출 시간을 사용하여 스캔됩니다.
현미경 작동 소프트웨어에서 작업 중인 MSI 필드를 획득한 다음 프로세스 슬라이드를 클릭하여 20배 배율로 관심 영역을 획득합니다. 관심 영역을 획득하면 기계 학습 소프트웨어에서 수동 분석 탭에서 파일 및 열기를 클릭하여 멀티플렉스 스테인드 이미지를 로드합니다. 스펙트럼 라이브러리 소스를 선택하고 바닥 선택을 클릭하여 이전에 저장된 스펙트럼 라이브러리를 선택합니다.
파일 및 열기를 클릭하여 얼룩이 없는 이미지를 로드합니다. 그런 다음 자동 불피성 잉크 마커 아이콘을 클릭하고 스테인드 슬라이드에 선 또는 영역을 그려 조직 내의 자동 형광을 식별합니다. 그런 다음 마커 및 색상 편집 탭에서 각 마커에 대한 이름을 할당하고 모두 준비를 클릭합니다.
기계 학습 소프트웨어에서 스펙트럼 혼합 되지 않은 이미지를 확인한 후 패널에서 세포막 및 마커 옵션을 선택합니다. 그리고 타원 버튼을 사용하여, 이 신호를 사용하여 핵, 세포질 또는 막을 검출하기 위해 마커를 구성한다. 세포질 또는 멤브레인 마커를 선택하면 핵 분할 옵션을 지원하기 위해 신호 사용법을 선택합니다.
이 소프트웨어는 핵, 세포질 및 멤브레인에 대한 개별 마스크를 자동으로 감지하고 생성합니다. 소프트웨어의 특정 마커 및 구성 옵션에 대한 병리학 보기를 사용하여 마스크를 조정하고 세그먼트 모두를 클릭하여 셀 세분화 맵을 만듭니다. 세포 세분화 후 마커를 선택하여 양수 세포를 표현합니다.
또한, 선택된 마커로 염색되지 않은 적어도 5개의 세포를 선택하여 음세포를 표현한다. 그런 다음 Train Classifier를 클릭하여 소프트웨어를 학습하여 이미지 내에서 선택한 마커로 얼룩진 모든 셀을 자동으로 감지합니다. 표현형 맵이 만들어집니다.
이러한 심상이 입증된 바와 같이, 혈류 세포측정을 위해 검증된 항체는 반자동 이미징 시스템에서 액정 튜닝 필터를 사용하여 조직 염색을 시각화하는 데 사용될 수 있다. 여기서 는 여포 발아 센터 내의 B 세포 및 증식 세포의 라벨링, 및 간 여포 T 세포 영역의 확산을 포함하는 고정된 인간 편도선의 반사혼합 이미지를 관찰할 수 있다. 병리학 보기 옵션은 관심있는 조직 내의 각 마커에 대한 개별 염색 패턴을 시각화 할 수 있으며, 멀티 플렉스 염색 방법 및 스펙트럼 이미징이 냉동 조직에 작용함을 시사합니다.
냉동 마우스 종양 섹션에서 입증된 바와 같이, 다중 스펙트럼 이미징은 또한 종양 침투 T 세포, 및 종양 관련 대식세포를 포함한 다른 골수성 세포 계보를 시각화하는 데 사용될 수 있다. 세포 세분화 및 표현형 맵, 소프트웨어에 의해 분석된 각 마커에 대한 스테인드 셀의 수가 생성될 수 있으며, 이는 소프트웨어가 냉동 조직에 대한 다중 스펙트럼 염색의 정량화에 사용될 수 있음을 입증한다. 새로운 6to 기술의 경우, 플루오로크롬의 특정 특징을 파악하고 스펙트럼 을 최소화한 스펙트럼 중복으로 스펙트럼 을 풀기 위한 고품질 라이브러리 슬라이드를 준비하는 것이 중요합니다.
항체 적정을 수행하는 것도 중요합니다. 우리의 의견으로는, 이 방법은 특히 타이밍이 본질일 때 암 및 그밖 치료 응용을 위한 면역 요법의 효험에 관하여 침대 측 정보를 제공할 수 있습니다.
