שיטות תרבות משופרות עבור דגימות גידול שמקורן בחולה חשובות ביותר כאשר השדה מתרחק מהשימוש בקווי תאים קונבנציונליים. פרוטוקול זה מאפשר את תרבות ההקדמה של תאים סרטניים שמקורם בחולה בפלטפורמה כי הוא נוח תפוקה גבוהה הקרנת תוכן גבוה, שלא כמו במודלים סרטן vivo. הפלטפורמה המשלבת PDXs מאפשרת לנו להעריך מערכות הטרוגניות יותר המשקפות גידולים מקומיים.
זה עשוי להניב תובנה לתוך מנגנוני סמים ולאפשר הקרנת סמים מהירה יותר. ניתן להרחיב את השיטה באמצעות שילוב של סטרומה, אנדותל ותאי חיסון. תרבויות שיתוף אלה יכולות להיות אפילו יותר משקף את האוכלוסייה הגידול הילידי ואת הארכיטקטורה.
תרגול טעינת הלוחות microfluidic עם קווי תאים מורחבים בקלות להיות מיומן מאוד לפני המעבר לתאים יקרים יותר כמו PDXs. יישור במהלך חלוקת צלחת משפיע מאוד על ההצלחה, והדגמה חזותית יכולה בקלות להעביר את המושג הזה. כדי להתחיל, להעביר רקמת הגידול לצינור חרוט סטרילי 50 מיליליטר שקל מראש.
לשטוף שש פעמים עם 30 מיליליטר של PBS סטרילי כדי להסיר דם ומזהמים. הסר נוזל רב ככל האפשר, ולשקול את רקמת הגידול. מעבירים את רקמת הגידול לצלחת תרבות רקמה עגולה של 60 מ"מ, ולהשתמש בסכין גילוח סטרילי או באזמל כדי לטחון אותו לחתיכות של מילימטר אחד.
הוסף חמישה מיליליטר של מדיום עיבוד PDX כדי לאסוף את תרחיף הגידול. הוסף חמישה מיליליטר של פתרון אנזים דיסוציאציה כדי לאסוף את תרחיף הגידול. שטפו את צלחת התרבות עם עוד חמישה מיליליטר של פתרון אנזים דיסוציאציה.
לאחר מכן הוסיפו חמישה מיליליטר של מדיום עיבוד PDX. דגירה 20 דקות ב 37 מעלות צלזיוס עם רעידות עדינות. באמצע זמן הדגירה, מערבל את הצינור בעדינות.
לאחר הדגירה, פיפטה למעלה ולמטה בעדינות עם פיפטה סרולוגית כדי לשבור גושים. מניחים מסננת תאים של 70 מיקרון מעל צינור סטרילי חדש של 50 מיליליטר, ומסננים את התאים. ואז צנטריפוגה ב 1, 200 סל"ד במשך שתי דקות כדי גלולה את התאים.
הסר את העל-טבעי ולחץ מחדש בשניים עד שלושה מיליליטר של מדיום תרבות PDX. לספור את התאים באמצעות מד חמוציט או מונה תאים אוטומטי. השתמש בטבלה זו כדי להעריך את המספר הנדרש של התאים הנגזרים משויכים PDX הדרושים כדי להשיג את צפיפות התאים הרצויה לכל שבב.
צלחת אחת עד פעמיים 10 לשישה תאים בחמישה מיליליטר של מדיום תרבות PDX לכל באר של צלחת תרבות רקמה שש בארות. דגירה במשך 48 שעות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% פחמן דו חמצני, ו 95% לחות עם רעידות עדינות ב 50 עד 55 סל"ד כדי לקדם היווצרות אשכול. לאחר שהאשכולות נוצרו, המשך לצנטריפוגה.
ראשית להכין 20 מיליליטר של 100% צפיפות שיפוע פתרון על ידי ערבוב יסודי 18 מיליליטר של פתרון צנטריפוגה שיפוע צפיפות עם שני מיליליטר של HBSS סטרילי 10X בצינור חרוט סטרילי 50 מיליליטר. לדלל פתרון זה 100%עם HBSS סטרילי 1X כדי להפוך 10 מיליליטר כל אחד 20%30%40% ו 55% פתרונות הדרגתיים צפיפות. הוסף שלושה מיליליטר של 55% צפיפות שיפוע פתרון לתחתית צינור חרוט 15 מיליליטר.
מחזיק את הצינור בזווית, לאט לוותר על שלושה מיליליטר של 40% צפיפות שיפוע פתרון על הצד הזוויתי של הצינור ועל גבי שכבת 55%. חזור על הפעולה עם פתרון מעבר הצבע של 30%density. לאחר מכן לאסוף את העל-טבעי של תרבות סיבוב PDX עם פיפטה סרולוגית חמישה מיליליטר לתוך צינור, לשטוף את פני הלוח בעדינות.
צנטריפוגה ב 1, 200 סל"ד במשך שתי דקות לתאי גלולה. הסר את supernatant, ו resuspend גלולת התא בשלושה מיליליטר של 20%צפיפות שיפוע פתרון. בזהירות שכבת פתרון הדרגתי 20%density עם תאים על החלק העליון של המילוי ההדרגתי בצינור 15 מיליליטר.
מכסים את הצינורות והצנטריפוגה בצנטריפוגה רוטור דלי נדנדה 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס, 2, 000 פעמים G, ואפס הפסקה. לאחר צנטריפוגה, שברים גלויים. תרבויות תא PDX קיימא נמצאות בדרך כלל בממשק פתרון הדרגתי של 40 עד 55%.density.
לאסוף שניים עד שלושה מיליליטר של כל שבר לתוך צינורות טריים 15 מיליליטר. הוסף שלושה עד ארבעה כרכים של HBSS סטרילי 1X לכל שבר, והתהפך כדי לערבב ביסודיות. צנטריפוגה ב 1, 000 פעמים G במשך שלוש דקות כדי גלולה התאים.
הסר את העל-טבעי. תן שימוש חוזר לכדור התא באחד עד שני מיליליטר של מדיום עיבוד PDX. מעבירים אליטוט קטן בין 50 ל-100 מיקרוליטרים לצינור, ומוסיפים נפח שווה של תמיסת אנזים דיסוציאציה להקצאה מחדש.
הערך את מספר התא בהשעיית התא המקובצים באשכולות. לספור את התאים עם מד חמוציט או מונה תאים אוטומטי. יש לצרף מחדש את פתרונות ההידרוגל של החומצה היאלורונית בהתאם להוראות היצרן.
באמצעות פיפטה רב ערוצית, להוסיף 50 microliters של HBSS לכל הבארים בעמודי חלון תצפית של צלחת microfluidic שני נתיבים כדי לשמור על לחות תרבותית ותנאי הדמיה אופטימליים. לחשב את נפח ההשעיה התא הדרוש עבור 50 microliters של הידרוג'ל בצפיפות התא הרצויה, למשל, 5, 000 תאים לכל microliter. עבור זריעת צלחת microfluidic אחת, aliquot את הנפח המחושב לתוך כל אחד מארבעה סטרילי 1.5 מיליליטר צינורות צנטריפוגה.
להתאים את ה- pH של פתרון תיול HA לשמונה עם 1 הידרוקסיד נתרן נורמלי מיד לפני השימוש. בצע בדיקה gelation על ידי ערבוב 40 microliters של תיול HA עם 10 microliters של PEGdA וניטור gelation לאורך זמן. לאחר מכן, צנטריפוגה עליקוט ההשעיה התא במשך שתי דקות ב 200 פעמים G וטמפרטורת החדר כדי גלולה את התאים.
בזהירות להסיר את supernatant, ו resuspend התאים ב 40 microliters של הא thiol עבור נפח סופי 50 מיקרוליטר. הוסף 10 מיקרוליטרים של PEGdA לאליקוט אחד של התאים של הא תיול. מערבבים היטב, ומחכים שעה עד שלוש דקות לפני הזריעה של הצלחת המיקרופלואידית.
להדביק טיפ עבור חלוקת 1.5 microliters ל pipette חוזר ערוץ יחיד, ולטעון עם התאים בתמיסת הידרוג'ל HA. זכור לשמור על אליקוט המימן מעורבב היטב כדי להבטיח חלוקת תאים אחידה. כדי לזרוע את הצלחת microfluidic, ליישר את קצה פיפטה בניצב ללהב תוך הצבת בעדינות את הקצה במרכז אינץ 'ג'ל כדי להבטיח מגע אבל אין לחץ בעת חלוקת 1.5 microliters של פתרון הידרוג'ל.
שים לב למצב המילוי של הערוצים המיקרופלואידיים על ידי צפייה מהחלק העליון של הצלחת, תחתית הצלחת או על ידי מיקרוסקופ. הערך את הטעינה באמצעות איור זה כמדריך. דקה לאחר ההעמסה, הפוך את הצלחת תוך כדי הכנה לאליקוט הבא.
חזור על הזריעה של הלוח microfluidic עבור שלושת aliquots הנותרים של תאים בתתבת HA. לאחר מילוי כל השבבים, הדגירה את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס באינקובטור לח 45 דקות עד ג'לציה הושלמה. לאחר מכן, באמצעות המדריך שסופק, להבטיח את נדנדת חליטה מותקן באינקובטור תרבות התא עם הגדרת שפע הנכון בזווית של 14 מעלות ומרווחים של ארבע דקות.
הוסף 50 מיקרוליטרים של תא PDX בינוני לכל ההפניות הבינוניות. הקישו בעדינות על הצלחת על משטח כדי לעודד את הנוזל למלא את הערוצים המיקרופלואידיים. לאחר מכן הפוך את הצלחת כדי לבדוק אם הערוצים מלאים כראוי.
הוסף 50 מיקרוליטרים של DMEM/F-12 עבור כל אמצעי התקשורת. אם כל בועות אוויר לכודים בערוץ חליטה, להסיר על ידי הקשה עדינה של הצלחת על פני השטח. באמצעות טופס פריסת מיקרוסקופ וצלחת, הקלט הצלחת מילוי שבבים.
אל תכלול שבבים שלא מולאו כראוי בשימוש ניסיוני נוסף. מניחים את הצלחת על נדנדה מוטה להגדיר להטיה של 14 מעלות ומחזור של ארבע דקות כדי להתחיל חליטה. כל יומיים, להחליף את מדיום תרבות PDX, הראשון 50 microliters ב inlets, אז 50 microliters בשקעים.
במחקר זה, נדנדת זלול ניתנת לתיכנות הותקנה באינקובטור סטנדרטי לתרבות תאים עם מעיל מים, ולהבים מיקרופלואידיים דו-נתיביים הוכנו בארונות בטיחות ביולוגית סטנדרטיים לטעינה. יכולת הקיום והמורפולוגיה של תרבות PDX מיקרופלואידית תלת-מימדית הוערכו הן בתנאים מופרדים מצנטריפוגה בלתי נפרדים והן בתנאים מופרדים בין צנטריפוגות שיפוע צפיפות. ביום הראשון, אותן תרבויות שעברו את שיטת ההפרדה הציגו פי עשרה פחות תאים מתים בודדים בהשוואה לתרבויות לא נפרדות.
חשוב לציין שהאשכולות המופרדים כללו בעיקר תאים חיים. לא זוהה הבדל מובהק סטטיסטית עבור התפלגות גודל האשכול. תרבויות נשמרו עוד יותר בצלחת המיקרופלואידית במשך שבעה ימים.
המספר הכולל של תאים חיים נותר עקבי, ואשכולות שמרו על כ-80% כדאיות לאורך חיי התרבות. זכור כי כל קו PDX הוא ייחודי, ולכן הקלות של עיכול הגידול, גודל פנוטיפי ומורפולוגיה של אשכולות, ואת המיקום של האשכול בתוך טיהור הדרגתי ישתנו. ניתן לסמן תרבויות PDX שהוקמו בשיטה זו באמצעות בדיקות כדאיות מבוססות-תמונה או לוח-קורא, תוויות קבועות ואימונופלואורסצנטיות, או ניתוק כדי לאסוף lysates תאים עבור פרוטוקולים אחרים.
השיטה תאפשר לחוקרים לכבוש מחדש את המיקרו-וירוס הגידולי על מנת לחקור ביולוגיה או תגובה תרופתית של תאים סרטניים. משתמשים צריכים להשלים אימון נושאים אנושיים סטנדרטיים ואימון פתוגנים המועברים בדם לפני העבודה עם רקמות שמקורן בבני אדם. ציוד מגן אישי מתאים צריך להיות משוחק.
