تحسين أساليب الثقافة لعينات الورم المستمدة من المريض هي ذات أهمية حاسمة كما يتحرك الحقل بعيدا عن استخدام خطوط الخلايا التقليدية. يسمح هذا البروتوكول للثقافة في المختبر من الخلايا السرطانية المستمدة من المريض في منصة قابلة للإنتاجية عالية وعالية المحتوى الفحص، على عكس نماذج سرطان الجسم الحي. منصة دمج PDXs يسمح لنا لتقييم أنظمة أكثر غير متجانسة تعكس الأورام الأصلية.
وهذا قد يؤدي إلى نظرة ثاقبة آليات المخدرات ويسمح للفحص أسرع المخدرات. ويمكن توسيع هذه الطريقة من خلال دمج ستروما، البطين، والخلايا المناعية. هذه الثقافات المشتركة يمكن أن تكون أكثر تعبيرا عن السكان الأورام الأصلية والهندسة المعمارية.
ممارسة تحميل لوحات microfluidic مع خطوط الخلايا الموسعة بسهولة لتصبح كفاءة عالية قبل التحول إلى خلايا أكثر قيمة مثل PDXs. محاذاة خلال لوحة الاستغناء يؤثر على النجاح بشكل كبير، ويمكن بسهولة مظاهرة بصرية نقل هذا المفهوم. للبدء، نقل أنسجة الورم إلى أنبوب مخروطي مخروطي معقم يزن ما قبل الوزن 50 ملليلتر.
شطف ست مرات مع 30 ملليلتر من برنامج تلفزيوني عقيم لإزالة الدم والملوثات. إزالة أكبر قدر ممكن من السائل، وزن أنسجة الورم. نقل أنسجة الورم إلى طبق زراعة الأنسجة المستديرة 60 ملليمترًا ، واستخدم شفرة حلاقة معقمة أو مشرطًا لتلكمه إلى قطع من ملليمتر واحد.
إضافة خمسة ملليلتر من PDX معالجة المتوسطة لجمع الطين الورم. إضافة خمسة ملليلتر من محلول انزيم الانفصام لجمع ملاط الورم. شطف طبق الثقافة مع خمسة ملليلتر آخر من محلول انزيم الانفصام.
ثم إضافة خمسة ملليلتر من PDX معالجة المتوسطة. احتضان 20 دقيقة في 37 درجة مئوية مع اهتزاز لطيف. في منتصف الوقت الحضانة، دوامة الأنبوب بلطف.
بعد الحضانة، ماصة صعودا وهبوطا بلطف مع ماصة المصلية لتفريق كتل. ضع مصفاة خلايا 70 ميكرون فوق أنبوب جديد معقمة 50 ملليلتر، وتصفية الخلايا. ثم الطرد المركزي في 1، 200 دورة في الدقيقة لمدة دقيقتين ل بيليه الخلايا.
إزالة افرنح و resuspend في 2-3 ملليلتر من وسط ثقافة PDX. عد الخلايا باستخدام مقياس الهيموسيت أو عداد الخلايا الآلي. استخدم هذا الجدول لتقدير العدد المطلوب من الخلايا المشتقة من PDX المرتبطة المطلوبة لتحقيق كثافة الخلايا المطلوبة لكل شريحة.
لوحة واحدة إلى مرتين 10 مرات إلى الخلايا الست في خمسة ملليلتر من ثقافة PDX المتوسطة في بئر من ستة بئر لوحة ثقافة الأنسجة. احتضان لمدة 48 ساعة في 37 درجة مئوية، 5٪ ثاني أكسيد الكربون، و 95٪ الرطوبة مع اهتزاز لطيف في 50 إلى 55 دورة في الدقيقة لتعزيز تشكيل الكتلة. بعد تشكيل المجموعات، انتقل إلى الطرد المركزي.
أولا إعداد 20 ملليلتر من 100٪ حل التدرج كثافة عن طريق خلط دقيق 18 ملليلتر من حل التدرّج المركزي الكثافة مع مليلترين من HBSS معقم 10X في أنبوب مخروطي معقم 50 ملليلتر. تخفيف هذا الحل 100٪ مع 1X HBSS عقيمة لجعل 10 ملليلتر كل من 20٪ 30٪ 40٪ و 55٪ حلول التدرج الكثافة. إضافة ثلاثة ملليلتر من 55٪ حل التدرج كثافة إلى الجزء السفلي من أنبوب مخروطي 15 ملليلتر.
عقد الأنبوب في زاوية، الاستغناء ببطء ثلاثة ملليلتر من 40٪ حل التدرج كثافة على الجانب الزاوية من الأنبوب وعلى رأس طبقة 55٪. كرر مع حل التدرج الكثافة 30٪. ثم جمع افرائب من الثقافات دوران PDX مع ماصة المصلية خمسة ملليلتر في أنبوب، شطف سطح لوحة بلطف.
جهاز طرد مركزي في 1، 200 دورة في الدقيقة لمدة دقيقتين لخلايا بيليه. إزالة فائقة، وإعادة فرض بيليه الخلية في ثلاثة ملليلتر من 20٪ حل التدرج الكثافة. قم بطبقة بعناية على حل التدرج الكثافة 20٪ مع الخلايا على الجزء العلوي من التدرج في أنبوب 15 ملليلتر.
سقف الأنابيب والطرد المركزي في جهاز طرد مركزي الدوار سوينغ دلو 30 دقيقة في أربع درجات مئوية، 2، 000 مرات G، وكسر صفر. بعد الطرد المركزي، تكون الكسور مرئية. عادة ما يتم العثور على ثقافات خلايا PDX قابلة للحياة في واجهة حل التدرج الكثافة 40 إلى 55٪ .
جمع 2-3 ملليلتر من كل كسر في أنابيب 15 ملليلتر الطازجة. إضافة ثلاثة إلى أربعة مجلدات من 1X HBSS العقيمة إلى كل كسر، وعكس لخلط دقيق. جهاز طرد مركزي في 1،000 مرة G لمدة ثلاث دقائق ل بيليه الخلايا.
إزالة المناط. Resuspend بيليه الخلية في ملليلتر واحد إلى اثنين من PDX معالجة المتوسطة. نقل aliquot صغيرة بين 50 إلى 100 ميكرولترات في أنبوب، وإضافة حجم مساو من محلول انزيم الانفصام لإعادة التوثيق.
تقييم رقم الخلية في نظام التعليق خلية متفاوت المسافات. عد الخلايا مع قياس الهيموسيت أو عداد الخلايا الآلي. إعادة تشكيل هيدروجيل حمض الهيالوروني وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
باستخدام ماصة متعددة القنوات، إضافة 50 ميكرولترات من HBSS إلى جميع الآبار في أعمدة نافذة المراقبة من لوحة microfluidic ذات حارتين للحفاظ على الرطوبة الثقافة وظروف التصوير الأمثل. حساب حجم تعليق الخلية اللازمة ل50 ميكرولترات من هيدروجيل في كثافة الخلية المطلوبة، على سبيل المثال، 5،000 خلية لكل ميكرولتر. لبذات واحد microfluidic لوحة، aliquot الحجم المحسوب في كل من أربعة أنابيب أجهزة الطرد المركزي 1.5 ملليلتر معقمة.
ضبط درجة حِسِّ حل HA thiol إلى ثمانية مع 1 هيدروكسيد الصوديوم العادي قبل الاستخدام مباشرة. إجراء اختبار هلام عن طريق خلط 40 ميكرولترات من ها thiol مع 10 ميكرولترات من PEGdA ورصد هلام مع مرور الوقت. بعد ذلك، الطرد المركزي تعليق الخلية aliquots لمدة دقيقتين في 200 مرة G ودرجة حرارة الغرفة إلى بيليه الخلايا.
إزالة بعناية فائقة، وإعادة تعليق الخلايا في 40 ميكرولتر من ها ثيول لحجم النهائي 50 ميكرولتر. إضافة 10 ميكرولترات من PEGdA إلى aliquot واحد من خلايا ها ثيول. تخلط جيدا، وانتظر من واحد إلى ثلاث دقائق قبل البذر لوحة microfluidic.
قم بلصق طرف لتوزيع 1.5 ميكرولتررس على ماصة مكررة من قناة واحدة، وتحميلها مع الخلايا في حل هيدروجيل HA. تذكر أن تبقي aliquot الهيدروجين مختلطة جيدا لضمان توزيع الخلايا حتى. لبذات لوحة microfluidic، محاذاة طرف ماصة عمودي على شفرة في حين وضع بلطف تلميح في وسط مدخل هلام لضمان الاتصال ولكن لا يوجد ضغط عند الاستغناء 1.5 ميكرولترات من محلول هيدروجيل.
مراقبة حالة التعبئة للقنوات microfluidic من خلال عرض من أعلى لوحة، أسفل لوحة، أو عن طريق المجهر. تقييم التحميل باستخدام هذا الرقم كدليل. بعد دقيقة واحدة من التحميل، عكس لوحة أثناء التحضير لألكوت المقبل.
كرر البذر من لوحة microfluidic ل aliquots الثلاثة المتبقية من الخلايا في حل HA. بعد ملء جميع الرقائق، احتضان لوحة في 37 درجة مئوية في حاضنة مرطب 45 دقيقة حتى يتم الانتهاء من هلام. بعد ذلك ، باستخدام الدليل المقدم ، تأكد من تثبيت الروك perfusion في حاضنة ثقافة الخلية مع إعداد الوفرة الصحيحة في زاوية 14 درجة وفترات أربع دقائق.
إضافة 50 ميكروليترس من ثقافة خلية PDX المتوسطة لجميع المداخل المتوسطة. اضغط بلطف على اللوحة مقابل السطح لتشجيع السائل على ملء القنوات microfluidic. ثم قم بقلب اللوحة للتحقق مما إذا كانت القنوات ممتلئة بشكل صحيح.
إضافة 50 ميكرولتر من DMEM/F-12 لجميع وسائل الإعلام. إذا كانت هناك أي فقاعات الهواء المحاصرين في قناة الضخ، وإزالة عن طريق التنصت لطيف من لوحة ضد سطح. باستخدام المجهر وشكل تخطيط لوحة، سجل رقاقة ملء النجاح.
استبعاد الرقائق المعبأة بشكل غير صحيح من الاستخدام التجريبي الإضافي. ضع اللوحة على جهاز روك مائل تم تعيينه إلى إمالة 14 درجة ودورة مدتها أربع دقائق للبدء في التسريب. كل يومين، استبدال متوسط ثقافة PDX، أول 50 ميكرولترات في المداخل، ثم 50 ميكرولترات في المنافذ.
في هذه الدراسة، تم تركيب الروك perfusion للبرمجة في حاضنة ثقافة الخلايا ذات السترات المائية القياسية، وتم إعداد شفرات microfluidic ذات الممرين في خزانة السلامة الحيوية القياسية للتحميل. تم تقييم 3D microfluidic PDX ثقافة البقاء ومورفولوجيا في كل من ظروف غير مفككة وكثافة الانحدار فصل. في اليوم الأول، أظهرت تلك الثقافات التي خضعت لطريقة الفصل خلايا ميتة واحدة أقل بعشرة أضعاف مقارنة بالثقافات غير المُزَوَّرة.
الأهم من ذلك، مجموعات منفصلة تتألف في المقام الأول من خلايا حية. ولم يتم تحديد أي فرق ذي دلالة إحصائية فيما يتعلق بتوزيع حجم الكتلة. كما تم الحفاظ على الثقافات في لوحة المايكرولويدي لمدة سبعة أيام.
بقي الرقم إجماليّة من خلايا حيّة متوافقة, و [كتل] يحتبس تقريبا 80٪ قابلية للتطبيق على الحياة من الثقافة. تذكر أن كل خط PDX فريد من نوعه ، لذلك فإن سهولة هضم الورم ، وحجم الظاهرة والمورفولوجيا من المجموعات ، وموقع الكتلة داخل تنقية التدرج سوف تختلف. يمكن إجراء عمليات الزرع في PDX باستخدام هذه الطريقة باستخدام مقايسات الجدوى المستندة إلى صورة أو لوحة تستند إلى قارئ، أو التحلل الثابت والميناعي المسمى، أو تفكيكها لجمع الخلايا البروتوكولات الأخرى.
وسوف تسمح هذه الطريقة للباحثين لتكبيل البيئة الورم من أجل استكشاف علم الأحياء أو استجابة المخدرات من الخلايا السرطانية. يجب على المستخدمين إكمال تدريب الأشخاص البشريين القياسيين وتدريب مسببات الأمراض المنقولة بالدم قبل العمل مع الأنسجة المشتقة من الإنسان. يجب ارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة.
