Улучшенные методы культуры для пациент-полученных образцов тумора критически важны по мере того как поле двигает далеко от пользы обычных линий клетки. Этот протокол позволяет в пробирке культуры пациентов полученных опухолевых клеток в платформе, которая подменяется высокой пропускной способности и высокое содержание скрининга, в отличие от моделей рака in vivo. Платформа, включающая PDX, позволяет нам оценивать более неоднородные системы, отражающие местные опухоли.
Это может дать представление о механизмах наркотиков и обеспечить более быстрый скрининг наркотиков. Метод может быть расширен за счет включения стромы, эндотелия и иммунных клеток. Эти совместно культуры могут быть еще более отражающими коренные популяции опухолей и архитектуры.
Практика загрузки микрофлюидных пластин с легко расширенными клеточными линиями, чтобы стать очень опытным, прежде чем переходят к более драгоценным клеткам, как PDXs. Выравнивание во время распределения пластины значительно влияет на успех, и визуальная демонстрация может легко передать эту концепцию. Для начала перенесите опухолевую ткань в предварительно взвешенную стерильную 50-миллилитровую коническую трубку.
Промыть шесть раз с 30 миллилитров стерильных PBS для удаления крови и загрязняющих веществ. Удалите как можно больше жидкости и взвесит опухолевые ткани. Перенесите опухолевую ткань на 60-миллиметровую круглую ткань культуры блюдо, и использовать стерильные лезвия бритвы или скальпель, чтобы фарш его на один миллиметр штук.
Добавьте пять миллилитров среды обработки PDX для сбора опухолевой суспензии. Добавьте пять миллилитров раствора фермента диссоциации для сбора опухолевой суспензии. Промыть блюдо культуры с еще пять миллилитров диссоциации ферментного раствора.
Затем добавьте пять миллилитров среды обработки PDX. Инкубировать 20 минут при 37 градусах по Цельсию с нежной тряской. На полпути через инкубацио время, вихрь трубки мягко.
После инкубации, пипетка вверх и вниз осторожно с серологической пипетки, чтобы разбить сгустки. Поместите 70-микрон-клеточный ситечко на новую стерильную 50-миллилитровую трубку и процедите клетки. Затем центрифуга при 1200 об/мин в течение двух минут гранулировать клетки.
Удалите супернатант и resuspend в два-три миллилитров среды культуры PDX. Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра или автоматизированного счетчика клеток. Используйте эту таблицу для оценки необходимого количества связанных ячеек, полученных PDX, необходимых для достижения желаемой плотности клеток на чип.
Плита от одного до двух раз от 10 до шести клеток в пяти миллилитров PDX культуры среды на колодец из шести хорошо пластины культуры ткани. Инкубировать в течение 48 часов при 37 градусах по Цельсию, 5%углекислого газа и 95%влажности с нежной тряской при 50-55 об/мин для содействия образованию кластеров. После формирования кластеров приступайте к центрифугации.
Сначала приготовьте 20 миллилитров градиентного раствора 100%-ной плотности, тщательно смешивая 18 миллилитров раствора градиентной центрифугации плотности с двумя миллилитров стерильной 10X HBSS в стерильной 50-миллилитрной конической трубке. Разбавить этот 100%-ный раствор стерильным 1X HBSS, чтобы сделать 10 миллилитров каждый из 20%30%40%и 55%плотность градиентных решений. Добавьте три миллилитров градиентного раствора 55%-й плотности на дно 15-миллилитровой конической трубки.
Удерживая трубку под углом, медленно распределять три миллилитров 40%плотности градиентного раствора на угловой стороне трубки и на верхней части 55%слоя. Повторите с градиентом 30%-й плотности. Затем соберите супернатант культур вращения PDX с пятими миллилитровой серологической пипеткой в трубку, мягко опоясыв поверхность пластины.
Центрифуга при 1200 об/мин в течение двух минут гранулировать клетки. Удалите супернатант и повторно посовелите клеточные гранулы в три миллилитра градиентного раствора 20%плотности. Тщательно слой 20%density градиентный раствор с клетками на верхней части градиента в 15-миллилитровой трубки.
Крышка труб и центрифуг в качели ведро ротор центрифуги 30 минут при четырех градусах по Цельсию, 2000 раз G, и нулевой перерыв. После центрифугации видны фракции. Жизнеспособные культуры клеток PDX обычно находятся на интерфейсе градиентного решения плотности от 40 до 55%.
Соберите два-три миллилитров каждой фракции в свежие 15-миллилитровые трубки. Добавить три-четыре тома стерильных 1X HBSS к каждой фракции, и инвертировать тщательно перемешать. Центрифуга при 1000 Г в течение трех минут, чтобы гранулировать клетки.
Удалите супернатант. Повторное производство клеточных гранул в один-два миллилитров среды обработки PDX. Перенесите небольшой алицит от 50 до 100 микролитров в трубку и добавьте равный объем раствора фермента диссоциации для редиссоциации.
Оцените номер ячейки в кластерной подвеске ячейки. Подсчитайте клетки с гемоцитометром или автоматизированным счетчиком клеток. Восстановить гидрогельные растворы гиалуроновой кислоты в соответствии с инструкциями производителя.
Используя многоканальный пипетку, добавьте 50 микролитров HBSS ко всем скважинам в столбцах окна наблюдения двухполосной микрофлюидной пластины для поддержания влажности культуры и оптимальных условий визуализации. Рассчитайте объем клеточной суспензии, необходимый для 50 микролитров гидрогеля при желаемой плотности клеток, например, 5 000 клеток на микролитер. Для посева одной микрофлюидной пластины, aliquot рассчитанный объем в каждой из четырех стерильных 1,5-миллилитровых центрифуг труб.
Отрегулируйте рН раствора HA thiol до восьми с 1 нормальным гидроксидом натрия непосредственно перед использованием. Выполните тест гелеобразования путем смешивания 40 микролитров HA thiol с 10 микролитров PEGdA и мониторинга гелеобразования с течением времени. Далее центрифуга подвесной клетки aliquots в течение двух минут при 200 раз G и комнатной температуры гранулы клеток.
Тщательно удалите супернатант и повторно посовелите клетки в 40 микролитров HA thiol для 50-микролитрового конечного объема. Добавьте 10 микролитров PEGdA в одну алициту клеток HA thiol. Хорошо перемешать и подождать от одной до трех минут, прежде чем сеять микрофлюидную пластину.
Прикрепите наконечник для дозирования 1,5 микролитров к одноканайной повторяющейся пипетке и загрузите клетки в растворе гидрогеля HA. Не забудьте сохранить водород aliquot хорошо смешанные для обеспечения равномерного распределения клеток. Чтобы посеять микрофлюидную пластину, выровняйте наконечник пипетки перпендикулярно лезвию, аккуратно поместив кончик в центр входного геля, чтобы обеспечить контакт, но без давления при дозирование 1,5 микролитров гидрогеля раствора.
Наблюдайте за состоянием заполнения микрофлюидных каналов, просматривая с верхней части пластины, нижней части пластины или с помощью микроскопа. Оцените загрузку, используя эту цифру в качестве руководства. Через минуту после погрузки, инвертировать пластину во время подготовки к следующему aliquot.
Повторите посев микрофлюидной пластины для оставшихся трех алицитов клеток в растворе HA. После того, как все микросхемы заполнены, инкубировать пластину при 37 градусах по Цельсию во влажном инкубаторе 45 минут, пока гелеобразование не будет завершено. После этого, используя предоставленное руководство, убедитесь, что перфузионный рокер установлен в инкубаторе культуры клеток с правильным параметром изобилия под углом 14 градусов и четырехминутными интервалами.
Добавьте 50 микролитров среды культуры клеток PDX ко всем средним входам. Аккуратно коснитесь пластины о поверхность, чтобы стимулировать жидкость для заполнения микрофлюидных каналов. Затем переверните пластину, чтобы проверить, если каналы заполнены должным образом.
Добавьте 50 микролитров DMEM/F-12 для всех средств массовой информации. Если пузырьки воздуха оказались в ловушке в канале перфузии, удалите нежным нажатием пластины на поверхность. Используя форму макета микроскопа и пластины, записыв чип, заполняя успех.
Исключите неправильно заполненные чипы из дальнейшего экспериментального использования. Поместите пластину на наклонный рокер, установленный на 14-градусный наклон и четырехминутный цикл, чтобы начать перфузию. Каждые два дня, заменить PDX культуры среды, сначала 50 микролитров в бухтах, а затем 50 микролитров в торговых точках.
В этом исследовании в стандартном инкубаторе культуры клеток с водяными куртками был установлен программируемый перфузионные рокеры, а в стандартном кабинете биобезопасности для погрузки были подготовлены двухполосные микрофлюидные лезвия. 3D микрофлюидная культура PDX жизнеспособность и морфология были оценены как в несепарированных и плотности градиента центрифугации разделенных условиях. В первый день те культуры, которые прошли метод разделения, продемонстрировали в десять раз меньше одиночных мертвых клеток по сравнению с неразмещенными культурами.
Важно отметить, что разделенные кластеры в основном состояли из живых клеток. Статистически значимой разницы в распределении размеров кластера выявлено не было. Культуры также поддерживались в микрофлюидной пластине в течение семи дней.
Общее число живых клеток оставалось неизменным, и кластеры сохраняли примерно 80%-ную жизнеспособность в течение жизни культуры. Помните, что каждая линия PDX уникальна, поэтому легкость пищеварения опухоли, фенотипический размер и морфология кластеров, а также расположение кластера в рамках очистки градиента будет меняться. Культуры PDX, созданные с помощью этого метода, могут быть просасывания с помощью анализа жизнеспособности на основе изображения или считывателя пластин, фиксированной и иммунофлуоресцентной маркировки, или разобщены для сбора лизаторов клеток для других протоколов.
Метод позволит исследователям резюмировать микроокноронию опухоли для изучения биологии или лекарственной реакции опухолевых клеток. Пользователи должны пройти стандартную подготовку по человеческим предметам и обучению патогенов, перед работой с тканями, полученными человеком. Следует носить соответствующее средства индивидуальной защиты.
