Los métodos de cultivo mejorados para muestras de tumores derivados del paciente son de vital importancia a medida que el campo se aleja del uso de líneas celulares convencionales. Este protocolo permite el cultivo in vitro de células tumorales derivadas del paciente en una plataforma que es susceptible de alto rendimiento y cribado de alto contenido, a diferencia de los modelos de cáncer in vivo. La plataforma que incorpora PDX nos permite evaluar sistemas más heterogéneos que reflejan tumores nativos.
Esto puede producir información sobre los mecanismos de drogas y permitir una detección más rápida de los medicamentos. El método podría expandirse mediante la incorporación de estroma, endotelio y células inmunitarias. Estas coculturas podrían ser aún más reflexivas de la población tumoral nativa y la arquitectura.
Practique la carga de las placas microfluídicas con líneas celulares fácilmente expandidas para llegar a ser altamente competentes antes de cambiar a celdas más preciosas como PDX. Alineación durante la dosificación de placas afecta en gran medida el éxito, y una demostración visual puede transmitir fácilmente este concepto. Para comenzar, transfiera el tejido tumoral a un tubo cónico estéril prepesado de 50 mililitros.
Enjuague seis veces con 30 mililitros de PBS estéril para eliminar la sangre y los contaminantes. Retire tanto líquido como sea posible y pese el tejido tumoral. Transfiera el tejido tumoral a un plato de cultivo de tejido redondo de 60 milímetros, y use una cuchilla de afeitar estéril o un bisturí para picarlo en trozos de un milímetro.
Agregue cinco mililitros de medio de procesamiento de PDX para recoger la suspensión tumoral. Añadir cinco mililitros de solución enzimática de disociación para recoger la suspensión tumoral. Enjuague el plato de cultivo con otros cinco mililitros de solución enzimática de disociación.
A continuación, agregue cinco mililitros de medio de procesamiento PDX. Incubar 20 minutos a 37 grados centígrados con un suave temblor. A mitad del tiempo de incubación, gire suavemente el tubo.
Después de la incubación, pipetear suavemente hacia arriba y hacia abajo con una pipeta serológica para romper los grumos. Coloque un colador celular de 70 micras sobre un nuevo tubo estéril de 50 mililitros y filtre las células. Luego centrifugar a 1.200 rpm durante dos minutos para peletizar las células.
Retire el sobrenadante y resuspend en dos o tres mililitros de medio de cultivo PDX. Cuente las células utilizando un hemocitoómetro o un contador de células automatizado. Utilice esta tabla para estimar el número necesario de las células derivadas DE PDX asociadas necesarias para lograr la densidad de celdas deseada por chip.
Plato de una a dos veces 10 a las seis células en cinco mililitros de medio de cultivo PDX por pozo de una placa de cultivo de tejido de seis pozos. Incubar durante 48 horas a 37 grados Celsius, 5% dióxido de carbono y 95% de humedad con un suave temblor a 50 a 55 rpm para promover la formación de racimos. Después de que se hayan formado los racimos, proceda a la centrifugación.
Primero prepare 20 mililitros de solución de gradiente de densidad 100% mezclando a fondo 18 mililitros de solución de centrifugación de gradiente de densidad con dos mililitros de HBSS estéril 10X en un tubo cónico estéril de 50 mililitros. Diluir esta solución al 100% con HBSS 1X estéril para hacer 10 mililitros cada uno de 20%30%40% y 55% soluciones de gradiente de densidad. Agregue tres mililitros de solución de gradiente de densidad del 55% en la parte inferior de un tubo cónico de 15 mililitros.
Sosteniendo el tubo en un ángulo, prescinda lentamente tres mililitros de solución de gradiente de densidad del 40% en el lado en ángulo del tubo y en la parte superior de la capa del 55%. Repita con la solución de gradiente de densidad del 30%. A continuación, recoja el sobrenadante de los cultivos de rotación PDX con una pipeta serológica de cinco mililitros en un tubo, enjuagando suavemente la superficie de la placa.
Centrifugar a 1.200 rpm durante dos minutos hasta las células de pellet. Retire el sobrenadante y resuspendir el pellet celular en tres mililitros de solución de gradiente de densidad 20%. Capa cuidadosamente la solución de gradiente de densidad del 20% con células en la parte superior del gradiente en el tubo de 15 mililitros.
Tapa los tubos y centrífuga en una centrífuga de rotor oscilante-cubo 30 minutos a cuatro grados Celsius, 2.000 veces G y cero rotura. Después de la centrifugación, las fracciones son visibles. Los cultivos celulares PDX viables se encuentran típicamente en la interfaz de solución de gradiente de 40 a 55% densidad.
Recoge de dos a tres mililitros de cada fracción en tubos frescos de 15 mililitros. Agregue de tres a cuatro volúmenes de HBSS estéril 1X a cada fracción e invierta para mezclar a fondo. Centrifugar a 1.000 veces G durante tres minutos para peletizar las células.
Retire el sobrenadante. Resuspender el pellet celular en uno o dos mililitros de medio de procesamiento PDX. Transfiera una pequeña alícuota entre 50 y 100 microlitros a un tubo y agregue un volumen igual de solución enzimática de disociación para redissociación.
Evalúe el número de celda en la suspensión de celda agrupada. Cuente las células con un hemocitoómetro o un contador de células automatizado. Reconstituir las soluciones de hidrogel de ácido hialurónico de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Con una pipeta multicanal, añada 50 microlitros de HBSS a todos los pozos en columnas de ventanas de observación de una placa microfluídica de dos carriles para mantener la humedad del cultivo y las condiciones óptimas de imagen. Calcular el volumen de suspensión celular necesario para 50 microlitros de hidrogel a la densidad celular deseada, por ejemplo, 5.000 células por microlitro. Para sembrar una placa microfluídica, aliquot el volumen calculado en cada uno de cuatro tubos estériles de centrífuga de 1,5 mililitros.
Ajuste el pH de la solución de tiol HA a ocho con 1 hidróxido de sodio normal inmediatamente antes de su uso. Realice una geleración de prueba mezclando 40 microlitros de HA thiol con 10 microlitros de PEGdA y controlando la gelificación a lo largo del tiempo. A continuación, centrifugar las alícuotas de suspensión celular durante dos minutos a 200 veces G y temperatura ambiente para peletizar las células.
Retire con cuidado el sobrenadante y resuspendir las células en 40 microlitros de ha thiol para un volumen final de 50 microlitros. Añadir 10 microlitros de PEGdA a una alícuota de las células de HA thiol. Mezcle bien y espere de uno a tres minutos antes de sembrar la placa microfluídica.
Fije una punta para dispensar 1,5 microlitros a una pipeta repetitiva de un solo canal y cargue con las células en la solución de hidrogel HA. Recuerde mantener la alícuota de hidrógeno bien mezclada para asegurar una distribución uniforme de la célula. Para sembrar la placa microfluídica, alinee la punta de la pipeta perpendicular a la hoja mientras coloca suavemente la punta en el centro de la entrada de gel para asegurar el contacto, pero sin presión al dispensar 1,5 microlitros de solución de hidrogel.
Observe el estado de llenado de los canales microfluídicos visualizando desde la parte superior de la placa, la parte inferior de la placa o por microscopio. Evalúe la carga utilizando esta figura como guía. Un minuto después de la carga, invierta la placa mientras se prepara para la siguiente alícuota.
Repita la siembra de la placa microfluídica para las tres alícuotas restantes de las células en la solución HA. Después de llenar todas las virutas, incubar el plato a 37 grados Centígrados en una incubadora humidificada 45 minutos hasta que se complete la geleración. Después de eso, utilizando el manual proporcionado, asegúrese de que el balancín de perfusión esté instalado en la incubadora de cultivo celular con el ajuste de profusión correcto en ángulo de 14 grados e intervalos de cuatro minutos.
Agregue 50 microlitros de medio de cultivo celular PDX a todas las entradas medias. Toque suavemente la placa contra una superficie para animar al líquido a llenar los canales microfluídicos. A continuación, voltee la placa para comprobar si los canales están llenos correctamente.
Agregue 50 microlitros de DMEM/F-12 para todos los medios de comunicación. Si alguna burbuja de aire está atrapada en el canal de perfusión, retírela tocando suavemente la placa contra una superficie. Usando un microscopio y una forma de diseño de placa, registre el éxito del llenado de virutas.
Excluya las virutas mal rellenadas del uso experimental adicional. Coloque la placa sobre un balancín basculante basculante en una inclinación de 14 grados y un ciclo de cuatro minutos para comenzar la perfusión. Cada dos días, reemplace el medio de cultivo PDX, primero 50 microlitros en las entradas y luego 50 microlitros en las tomas de corriente.
En este estudio, se instaló un balancín de perfusión programable en una incubadora de cultivo celular con camisa de agua estándar, y se prepararon cuchillas microfluídicas de dos carriles en un gabinete de bioseguridad estándar para la carga. Se evaluó la viabilidad y morfología del cultivo PDX microfluídico 3D en condiciones separadas por centrifugación de gradiente de densidad y de densidad. En el primer día, aquellos cultivos que se sometieron al método de separación exhibieron diez veces menos células muertas individuales en comparación con cultivos no clasificados.
Es importante destacar que los clústeres separados consistían principalmente en celdas vivas. No se identificó ninguna diferencia estadísticamente significativa para la distribución del tamaño del clúster. Los cultivos se mantuvieron aún más en la placa microfluídica durante siete días.
El número total de células vivas se mantuvo constante, y los grupos retuvieron aproximadamente el 80% de viabilidad durante la vida del cultivo. Recuerde que cada línea PDX es única, por lo que la facilidad de la digestión tumoral, el tamaño fenotípico y la morfología de los racimos, y la ubicación del clúster dentro de la purificación del gradiente variarán. Los cultivos PDX establecidos con este método se pueden ensayar con ensayos de viabilidad basados en lectores de imágenes o placas, etiquetados fijas e inmunofluorescentes, o disociados para recoger lisatos celulares para otros protocolos.
El método permitirá a los investigadores recapitular el microambiente tumoral para explorar la biología o la respuesta farmacológica de las células tumorales. Los usuarios deben completar el entrenamiento estándar de sujetos humanos y la formación de patógenos transmitidos por la sangre antes de trabajar con tejidos derivados del ser humano. Se debe usar el equipo de protección personal adecuado.
