Alan konvansiyonel hücre hatlarının kullanımından uzaklaşır gibi hasta kaynaklı tümör örnekleri için geliştirilmiş kültür yöntemleri kritik öneme sahip. Bu protokol, in vivo kanser modellerinin aksine, yüksek iş ve yüksek içerik taraması için uygun bir platformda hasta kaynaklı tümör hücrelerinin in vitro kültür sağlar. PDX'leri içeren platform, yerli tümörleri yansıtan daha heterojen sistemleri değerlendirmemizi sağlar.
Bu, uyuşturucu mekanizmaları hakkında bilgi verebilir ve daha hızlı uyuşturucu taraması na olanak sağlayabilir. Yöntem stroma, endotel ve bağışıklık hücrelerinin dahil edilmesi yoluyla genişletilebilir. Bu ortak kültürler yerli tümör popülasyonu ve mimarisini daha da yansıtıcı olabilir.
PDXs gibi daha değerli hücrelere geçmeden önce son derece yeterli hale gelmek için mikroakışkan plakaları kolayca genişletilmiş hücre hatlarıile yükleme alıştırması. Başlamak için, önceden tartılmış steril 50 mililitrekonik tüp tümör dokusu transferi.
Kan ve kirletici maddeleri çıkarmak için steril PBS 30 mililitre ile altı kez durulayın. Mümkün olduğunca çok sıvı çıkarın ve tümör dokusu tartmak. Tümör dokusunu 60 milimetrelik yuvarlak doku kültür yemeğine aktarın ve steril bir jilet veya neşter kullanarak bir milimetrelik parçalara ayırın.
Tümör bulamaç toplamak için PDX işleme orta beş mililitre ekleyin. Tümör bulamaç toplamak için dissociation enzim çözeltisi beş mililitre ekleyin. Kültür yemeğini beş mililitre daha dissosiasyon enzim çözeltisi ile durulayın.
Sonra PDX işleme ortamı beş mililitre ekleyin. 37 santigrat derecede 20 dakika hafif çetrenle kuluçkaya yat. Kuluçka süresinin yarısında, tüpü yavaşça döndürün.
Kuluçkadan sonra, pipet yukarı ve aşağı yavaşça bir serolojik pipet ile kümeleri kırmak için. Yeni bir steril 50 mililitrelik tüp üzerine 70 mikron hücreli süzgeç yerleştirin ve hücreleri filtreleyin. Sonra hücreleri pelet lemek için iki dakika boyunca 1, 200 rpm santrifüj.
PdX kültür ortamının 2-3 mililitresinde süpernatant'ı çıkarın ve yeniden askıya alın. Hemositometre veya otomatik hücre sayacı kullanarak hücreleri sayın. Çip başına istenen hücre yoğunluğunu elde etmek için gerekli ilişkili PDX türetilmiş hücrelerin gerekli sayısını tahmin etmek için bu tabloyu kullanın.
Altı kuyulu doku kültürü plakası başına PDX kültür ortamının beş mililitresinde altı hücreye 1-2 çarpı 10 plaka. Küme oluşumunu teşvik etmek için 37 santigrat derece, %5 karbondioksit ve %95 nem ile %50 ila 55 rpm'de hafif sallayarak 48 saat kuluçkaya yatırın. Kümeler oluştuktan sonra santrifüjedine doğru ilerleyin.
İlk iyice steril 50 mililitrelik konik tüp steril 10X HBSS iki mililitre ile yoğunluk gradyan santrifüj çözeltisi 18 mililitre karıştırarak% 100 yoğunlukgradient çözüm 20 mililitre hazırlamak. Steril 1X HBSS ile bu % 100 çözüm seyreltmek 10 mililitre her 20% 30% 40 ve% 55 yoğunluk gradyan çözümleri yapmak. 15 mililitrelik konik tüpün dibine %55 yoğunluklu degrade çözeltisinin üç mililitresini ekleyin.
Tüpü bir açıda tutarak, tüpün açılı tarafına ve %55'lik katmanın üzerine %40 yoğunlukgradient çözeltisi üç mililitre yavaşça dağıtın. %30 yoğunluk gradyan çözeltisi ile tekrarlayın. Daha sonra bir tüp içine beş mililitrelik serolojik pipet ile PDX rotasyon kültürlerin supernatant toplamak, yavaşça plaka yüzeyi durulama.
Pelet hücrelerine iki dakika boyunca 1, 200 rpm'de santrifüj. Supernatant çıkarın ve% 20 yoğunluk gradyan çözeltisi üç mililitre hücre pelet resuspend. %20 yoğunlukgradient çözeltisini hücrelerle birlikte 15 mililitrelik tüpteki degradenin üstüne dikkatlice katlayın.
Dört santigrat derece, 2,000 kez G ve sıfır mola bir salıncak kova rotor santrifüj 30 dakika tüpler ve santrifüj kapağı. Santrifüjden sonra kesirler görünür. Uygun PDX hücre kültürleri genellikle % 40-55 yoğunlukgradyon çözüm arabiriminde bulunur.
Taze 15 mililitretüpler halinde her kesir iki ila üç mililitre toplayın. Her fraksiyona üç ila dört cilt steril 1X HBSS ekleyin ve iyice karıştırmak için tersine çevirin. Hücreleri peletlemek için üç dakika boyunca 1,000 kez G'de santrifüj.
Supernatant çıkarın. PDX işleme ortamının bir ila iki mililitre içinde hücre pelet yeniden askıya. Bir tüp içine 50 ila 100 mikrolitre arasında küçük bir aliquot aktarın ve redissociation için dissociation enzim çözeltisi eşit hacimli ekleyin.
Kümelenmiş hücre süspansiyonundaki hücre numarasını değerlendirin. Hemositometre veya otomatik hücre sayacı ile hücreleri sayın. Hyaluronik asit hidrojel çözeltilerini üreticinin talimatlarına göre yeniden oluştur.
Çok kanallı pipet kullanarak, kültür nemini ve optimum görüntüleme koşullarını korumak için iki şeritli mikroakışkan plakanın gözlem penceresi sütunlarında bulunan tüm kuyulara 50 mikrolitre HBSS ekleyin. 50 mikrolitre hidrojel için gerekli olan hücre süspansiyonunun hacmini istenilen hücre yoğunluğunda hesaplayın, örneğin, mikrolitre başına 5,000 hücre. Bir mikroakışkan plaka tohumlama için, dört steril 1.5 mililitrelik santrifüj tüplerin her biri içine hesaplanan hacmi aliquot.
Kullanmadan hemen önce 1 normal sodyum hidroksit ile HA tiol çözeltisinin pH'ını sekize ayarlayın. 40 mikrolitre HA tiyol ile 10 mikrolitre PEGdA'yı karıştırarak ve zaman içinde jelasyonu izleyerek bir test jelasyonu gerçekleştirin. Daha sonra, hücre süspansiyonu 200 kez G ve oda sıcaklığında iki dakika boyunca hücreleri pelet için santrifüj.
Dikkatle supernatant kaldırmak ve 50 mikrolitre son hacmi için HA tiyol 40 mikrolitre hücreleri yeniden askıya. HA tiyol hücrelerinin bir aliquot PEGdA 10 mikrolitre ekleyin. İyice karıştırın ve mikroakışkan plaka tohumlama önce 1-3 dakika bekleyin.
Tek kanallı yinelenen pipete 1,5 mikrolitre dağıtmak için bir ipucu yapıştırın ve HA hidrojel çözeltisindeki hücrelerle yükleyin. Hidrojen aliquot iyi bile hücre dağılımı sağlamak için karışık tutmak unutmayın. Mikroakışkan plakayı tohumlamak için pipet ucunu bıçak için dik olarak hizalayın ve ucu jel girişinin ortasına yerleştirerek 1,5 mikrolitre hidrojel çözeltisi dağıtırken temas ancak basınç yok.
Plakanın üst kısmından, tabağın altından veya mikroskopla görüntüleyerek mikroakışkan kanalların dolgu durumunu gözlemleyin. Bu rakamı kılavuz olarak kullanarak yüklemeyi değerlendirin. Yüklemeden bir dakika sonra, bir sonraki aliquot için hazırlanırken plakaters.
HA çözeltisindeki kalan üç hücre için mikroakışkan plakanın tohumlanmasını tekrarlayın. Tüm çipler doldurulduktan sonra, jelasyon tamamlanana kadar 45 dakika nemli bir kuluçka makinesinde 37 santigrat derecede plaka kuluçka. Bundan sonra, sağlanan kılavuzu kullanarak, perfüzyon rocker 14 derecelik açı ve dört dakikalık aralıklarla doğru profüzyon ayarı ile hücre kültürü kuluçka yüklü olduğundan emin olun.
Tüm orta girişlere 50 mikrolitre PDX hücre kültürü ekleyin. Sıvıyı mikroakışkan kanalları doldurmaya teşvik etmek için plakayı bir yüzeye hafifçe dokunun. Ardından, kanalların düzgün doldurulıp doldurulmamasını kontrol etmek için plakayı çevirin.
Tüm medya kuruluşları için 50 mikrolitre DMEM/F-12 ekleyin. Herhangi bir hava kabarcıkları perfüzyon kanalında sıkışıp ise, bir yüzeye plaka nazik dokunarak kaldırın. Bir mikroskop ve plaka düzeni formu kullanarak, kayıt çip dolum başarı.
Yanlış doldurulmuş yongaları daha fazla deneysel kullanımdan hariç tinler. Plakayı 14 dereceeğime ve perfüzyona başlamak için dört dakikalık bir döngüye ayarlanmış eğimli bir kayaç üzerine yerleştirin. Her iki günde bir, PDX kültür ortamını, girişlerde ilk 50 mikrolitreyi, sonra çıkışlarda 50 mikrolitreyi değiştirin.
Bu çalışmada, standart su ceketli hücre kültürü kuluçka makinesine programlanabilir bir perfüzyon rocker yerleştirildi ve yükleme için standart bir biyogüvenlik kabininde iki şeritli mikroakışkan bıçaklar hazırlandı. 3D mikroakışkan PDX kültür canlılığı ve morfolojisi hem ayrılmamış hem de yoğunluk gradyan santrifüjlü santrifüj ayrı koşullarda değerlendirildi. İlk gün, ayırma yöntemini kullanan kültürler, ayrılmamış kültürlere göre on kat daha az tek ölü hücre sergilediler.
Daha da önemlisi, ayrılmış kümeler öncelikle canlı hücrelerden oluşuyordu. Küme büyüklüğü dağılımı için istatistiksel olarak anlamlı bir fark saptanmadı. Kültürler daha yedi gün boyunca mikroakışkan plaka muhafaza edildi.
Toplam canlı hücre sayısı tutarlı kaldı ve kümeler kültürün yaşamı boyunca yaklaşık %80 canlılığını korudu. Her PDX hattının benzersiz olduğunu unutmayın, bu nedenle tümör sindirim kolaylığı, kümelerin fenotipik boyutu ve morfolojisi ve kümenin degrade saflaştırma içindeki konumu değişir. Bu yöntem kullanılarak kurulan PDX kültürleri, görüntü veya plaka okuyucu tabanlı canlılık tahlilleri, sabit ve immünoffloresan olarak etiketlenmiş veya diğer protokoller için hücre likatları toplamak için ayrıştırılabilir.
Bu yöntem, araştırmacıların tümör hücrelerinin biyoloji sini veya ilaç yanıtını araştırmak için tümör mikroçevresini yeniden özetlemelerine olanak sağlayacaktır. Kullanıcılar insan kaynaklı dokularla çalışmadan önce standart insan denekleri eğitimini ve kan yoluyla bulaşan patojeneğitimini tamamlamalıdır. Uygun kişisel koruyucu ekipman giyilmelidir.
